희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations
Summary
유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.
Abstract
시공간 유전자 전사는 전사를 제어하기 위해 표적 유전자 프로모터와의 물리적 근접성에 의존하는 인핸서 및 소음기와 같은 원위 조절 요소에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이러한 조절 요소는 식별하기 쉽지만 대부분이 세포 유형에 특이적이며 선형 게놈 서열에서 수백 킬로베이스로 분리되어 다른 비표적 유전자를 건너뛰기 때문에 표적 유전자를 예측하기 어렵습니다. 수년 동안 Promoter Capture Hi-C(PCHi-C)는 원위 조절 요소를 표적 유전자에 결합시키는 데 있어 황금 표준이었습니다. 그러나 PCHi-C는 수백만 개의 세포 가용성에 의존하여 일차 조직에서 일반적으로 얻은 것과 같은 희귀 세포 집단에 대한 연구를 금지합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 게놈의 각 유전자를 제어하는 원위 조절 요소의 레퍼토리를 식별하는 비용 효율적이고 맞춤형 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)가 개발되었습니다. liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 및 계산 프레임워크에 의존하지만 최소한의 튜브 변경을 사용하고 시약 농도 및 부피를 수정하고 단계를 바꾸거나 제거함으로써 라이브러리 구성 중 재료 손실을 최소화합니다. 총체적으로, liCHi-C는 발달 생물학 및 세포 기능의 맥락에서 유전자 조절 및 시공간 게놈 조직의 연구를 가능하게 합니다.
Introduction
시간적 유전자 발현은 세포 분화와 궁극적으로 유기체 발달을 유도하며, 그 변화는 광범위한 질병 1,2,3,4,5와 밀접한 관련이 있습니다. 유전자 전사는 조절 요소의 작용에 의해 미세하게 조절되며, 이는 근위부(즉, 유전자 프로모터) 및 원위부(예: 인핸서 또는 소음기)로 분류될 수 있으며, 후자는 종종 표적 유전자로부터 멀리 떨어져 있고 유전자 발현을 조절하기 위해 염색질 루핑을 통해 물리적으로 상호작용합니다 6,7,8.
게놈에서 원위 조절 영역의 식별은 널리 합의된 문제인데, 이 영역은 특정 히스톤 변형 9,10,11을 포함하고 특정 전사 인자 인식 모티프를 포함하여 이들에 대한 모집 플랫폼 역할을 하기 때문입니다(12,13,14). 게다가, 인핸서(enhancers)와 수퍼-인핸서(super-enhancer)15,16의 경우, 이들은 또한 낮은 뉴클레오솜 점유(low-nucleosome occupancy)17,18를 가지며, 비-코딩 eRNAs(non-coding eRNA)로 전사된다(19,20).
그럼에도 불구하고 각 원위 조절 요소의 표적 유전자는 예측하기가 더 어렵습니다. 종종 원위 조절 요소와 표적 사이의 상호 작용은 세포 유형 및 자극 특이적이며21,22, 수백 킬로베이스에 걸쳐 있으며, 어떤 방향으로든 다른 유전자를 연결하고23,24,25 표적 유전자 또는 다른 비개입 유전자의 인트로닉 영역 내부에 위치할 수도 있습니다26,27. 또한, 원위 조절 요소는 동시에 하나 이상의 유전자를 제어 할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다28,29. 이러한 위치 복잡성은 이들 사이의 조절 연관성을 정확히 찾아내는 것을 방해하므로 모든 세포 유형에서 각 조절 요소의 표적 대부분은 알려지지 않은 상태로 남아 있습니다.
최근 몇 년 동안 염색질 상호작용을 연구하기 위한 염색체 형태 포획(3C) 기술의 개발이 크게 붐을 일으켰습니다. 그 중 가장 널리 사용되는 Hi-C는 세포 게놈30의 모든 단편 사이의 모든 상호 작용에 대한 지도를 생성할 수 있습니다. 그러나 제한 단편 수준에서 중요한 상호 작용을 감지하기 위해 Hi-C는 초심층 시퀀싱에 의존하여 개별 유전자의 조절 환경을 일상적으로 연구하는 데 사용하는 것을 금지합니다. 이러한 경제적 한계를 극복하기 위해 ChIA-PET31, HiChIP 32 및 저투입 대응 HiCuT 33과 같은 여러 농축 기반3C 기술이 등장했습니다. 이러한 기술은 특정 단백질에 의해 매개되는 게놈 차원의 상호작용을 풍부하게 하기 위한 항체의 사용에 의존한다. 그럼에도 불구하고 이러한 3C 기술의 고유한 기능은 응용 프로그램의 골칫거리이기도 합니다. 사용자는 관심 단백질에 대한 고품질 항체의 가용성에 의존하며 단백질의 결합이 동적인 조건을 비교할 수 없습니다.
프로모터 캡쳐 Hi-C(PCHi-C)는 이러한 제한(34,35)을 우회하는 또 다른 농축 기반3C 기술이다. PCHi-C는 비오티닐화 RNA 프로브 농축 시스템을 사용하여 28,650개의 인간 또는 27,595개의 마우스 주석이 달린 유전자 프로모터(프로모터 상호작용이라고도 함)와 상호 작용하는 게놈 영역의 게놈 전체 고해상도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 활성 및 비활성 프로모터 모두의 제한 단편 수준 분해능에서 중요한 장거리 상호작용을 검출할 수 있으며, 히스톤 변형 또는 단백질 결합의 역학과 독립적으로 모든 조건 간의 프로모터 상호작용을 강력하게 비교할 수 있습니다. PCHi-C는 세포 분화 동안 프로모터 상호작용체 재구성을 확인하고(36,37), 전사 인자(38,39)의 작용 메커니즘을 확인하고, 비암호화 변이체(40,41,42,43,44,45)에 의해 질병에서 조절되지 않는 새로운 잠재적 유전자 및 경로를 발견하기 위해 최근 몇 년 동안 널리 사용되어 왔다.46,47,48, 새로운 드라이버 비암호화 돌연변이49,50과 함께. 게다가, 단지 포획 시스템을 수정함으로써, 이 기술은 임의의 상호작용체(예를 들어, 인핸서 상호작용체(51) 또는 비-코딩 변경들의 집합체의 상호작용체(41, 52))를 조사하기 위해 생물학적 질문에 따라 맞춤화될 수 있다.
그러나 PCHi-C는 이 기술을 수행하기 위해 최소 2천만 개의 세포에 의존하므로 발달 생물학 및 임상 응용 분야에서 자주 사용되는 것과 같은 희소한 세포 집단에 대한 연구를 방해합니다. 이러한 이유로 우리는 낮은 셀 입력으로 고분해능 프로모터 상호 작용을 생성하기 위해 PCHi-C의 실험적 프레임워크를 기반으로 하는 새로운 비용 효율적이고 사용자 정의 가능한 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 개발했습니다. 최소한의 튜브 변경으로 실험을 수행하고, 원래의 PCHi-C 프로토콜에서 단계를 바꾸거나 제거하고, 반응 부피를 대폭 줄이고, 시약 농도를 수정함으로써 라이브러리 복잡성이 극대화되고 50,000개 이상의 세포로 고품질 라이브러리를 생성할 수 있습니다53.
낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)는 PCHi-C에 대해 벤치마킹되었으며 인간 조혈 세포 분화 동안 프로모터 상호작용 재배선을 밝히고, 비코딩 변경에 의해 조절되지 않는 잠재적인 새로운 질병 관련 유전자 및 경로를 발견하고, 염색체 이상을 감지하는 데 사용됩니다53. 단계별 프로토콜과 기술을 통한 다양한 품질 관리는 라이브러리의 최종 생성 및 계산 분석까지 여기에 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 프레임워크를 사용하지만 세포 수가 크게 감소한 고분해능 프로모터 상호작용체 라이브러리를 생성할 수 있는 기능을 제공합니다. 이것은 페놀 정제 및 비오틴 제거와 같은 불필요한 단계를 제거함으로써 크게 달성됩니다. 고전적인 핵 내 결찰 Hi-C 프로토콜57 및 후속 파생 기술인 PCHi-C에서, 비오틴은 나중에 정보가 없는 DNA 단편을 끌어내리는 것을 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고에 대한 피드백을 주신 Javierre 연구실의 나머지 구성원들에게 감사드립니다. 제도적 지원을 해주신 CERCA 프로그램, Generalitat de Catalunya 및 Josep Carreras Foundation에 감사드립니다. 이 연구는 FEDER/스페인 과학혁신부(RTI2018-094788-A-I00), 유럽 혈액학 협회(4823998) 및 스페인 암 퇴치 협회(AECC) LABAE21981JAVI의 자금 지원을 받았습니다. BMJ는 La Caixa Banking Foundation Junior Leader 프로젝트(LCF/BQ/PI19/11690001)에서 자금을 지원하고, LR은 AGAUR FI 펠로우십(2019FI-B00017)에서 자금을 지원하며, LT-D는 FPI Fellowship(PRE2019-088005)에서 자금을 지원합니다. Universitat Autònoma de Barcelona의 생화학 및 분자 생물학 박사 과정의 지원에 감사드립니다. 자금 제공자 중 누구도 실험 설계나 원고 작성의 어느 시점에도 관여하지 않았습니다.
Materials
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
| Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | – | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
| Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
| Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
| CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
| NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
| Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | – | |
| PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
| SDS – Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
| T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
| T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
| Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
| Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
Riferimenti
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