जीन अभिव्यक्ति को डिस्टल नियामक तत्वों के साथ जीन प्रमोटरों की बातचीत द्वारा विनियमित किया जाता है। यहां, हम बताते हैं कि कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी) दुर्लभ सेल प्रकारों में इन इंटरैक्शन की पहचान करने की अनुमति देता है, जो पहले मापने योग्य नहीं थे।
स्पैटियोटेम्पोरल जीन ट्रांसक्रिप्शन को डिस्टल नियामक तत्वों द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है, जैसे कि एन्हांसर और साइलेंसर, जो प्रतिलेखन को नियंत्रित करने के लिए अपने लक्ष्य जीन प्रमोटरों के साथ भौतिक निकटता पर भरोसा करते हैं। यद्यपि इन नियामक तत्वों की पहचान करना आसान है, उनके लक्ष्य जीन की भविष्यवाणी करना मुश्किल है, क्योंकि उनमें से अधिकांश सेल-प्रकार विशिष्ट हैं और रैखिक जीनोम अनुक्रम में सैकड़ों किलोबेस द्वारा अलग किए जा सकते हैं, अन्य गैर-लक्ष्य जीनों पर छोड़ दिए जा सकते हैं। कई वर्षों से, प्रमोटर कैप्चर हाई-सी (पीसीएचआई-सी) अपने लक्षित जीन के लिए डिस्टल नियामक तत्वों के जुड़ाव के लिए स्वर्ण मानक रहा है। हालांकि, पीसीएचआई-सी लाखों कोशिकाओं की उपलब्धता पर निर्भर करता है, जो दुर्लभ कोशिका आबादी के अध्ययन को प्रतिबंधित करता है जैसे कि आमतौर पर प्राथमिक ऊतकों से प्राप्त। इस सीमा को दूर करने के लिए, कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी), जीनोम के प्रत्येक जीन को नियंत्रित करने वाले डिस्टल नियामक तत्वों के प्रदर्शनों की पहचान करने के लिए एक लागत प्रभावी और अनुकूलन योग्य विधि विकसित की गई है। LICHI-C PCHI-C के समान प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल ढांचे पर निर्भर करता है, लेकिन न्यूनतम ट्यूब परिवर्तनों को नियोजित करके, अभिकर्मक एकाग्रता और मात्रा को संशोधित करके, और चरणों की अदला-बदली या समाप्त करके, यह पुस्तकालय निर्माण के दौरान न्यूनतम सामग्री हानि के लिए जिम्मेदार है। सामूहिक रूप से, LICHI-C विकासात्मक जीव विज्ञान और सेलुलर फ़ंक्शन के संदर्भ में जीन विनियमन और स्थानिक जीनोम संगठन के अध्ययन को सक्षम बनाता है।
अस्थायी जीन अभिव्यक्ति सेल भेदभाव और अंततः, जीव विकास को चलाती है, और इसका परिवर्तन बीमारियों की एक विस्तृत अधिकता से निकटता से संबंधित है 1,2,3,4,5. जीन प्रतिलेखन को नियामक तत्वों की कार्रवाई द्वारा बारीकी से विनियमित किया जाता है, जिसे समीपस्थ (यानी, जीन प्रमोटर) और डिस्टल (जैसे, एन्हांसर या साइलेंसर) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, जिनमें से उत्तरार्द्ध अक्सर अपने लक्ष्य जीन से दूर स्थित होते हैं और जीन अभिव्यक्ति 6,7,8 को संशोधित करने के लिए क्रोमैटिन लूपिंग के माध्यम से शारीरिक रूप से उनके साथ बातचीत करते हैं।
जीनोम में डिस्टल नियामक क्षेत्रों की पहचान एक ऐसा मामला है जिस पर व्यापक रूप से सहमति व्यक्त की जाती है, क्योंकि इन क्षेत्रों में विशिष्ट हिस्टोन संशोधन9,10,11 होते हैं और इनमें विशिष्ट प्रतिलेखन कारक पहचान रूपांकन होते हैं, जो उनके लिए भर्ती प्लेटफॉर्म के रूप में कार्य करते हैं। इसके अलावा, एन्हांसर और सुपर-एन्हांसर 15,16 के मामले में, उनके पास कम-न्यूक्लियोसोम अधिभोग 17,18 भी है और उन्हें गैर-कोडिंग ईआरएनए 19,20 में स्थानांतरित किया जाता है।
बहरहाल, प्रत्येक डिस्टल नियामक तत्व के लक्ष्य जीन की भविष्यवाणी करना अधिक कठिन है। अधिक बार नहीं, डिस्टल नियामक तत्वों और उनके लक्ष्यों के बीच बातचीत सेल-प्रकार और उत्तेजना विशिष्ट 21,22 होती है, सैकड़ों किलोबेस तक फैली होती है, किसी भी दिशा में अन्य जीनों पर ब्रिजिंग 23,24,25, और यहां तक कि उनके लक्षित जीन या अन्य गैर-हस्तक्षेप जीन26,27 के इनट्रोनिक क्षेत्रों के अंदर भी स्थित हो सकती है।. इसके अलावा, डिस्टल नियामक तत्व एक ही समय में एक से अधिक जीन को भी नियंत्रित कर सकते हैं, और इसके विपरीत28,29। यह स्थितिगत जटिलता उनके बीच नियामक संघों को इंगित करने में बाधा डालती है, और इसलिए, प्रत्येक सेल प्रकार में प्रत्येक नियामक तत्व के अधिकांश लक्ष्य अज्ञात रहते हैं।
हाल के वर्षों के दौरान, क्रोमैटिन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर (3 सी) तकनीकों के विकास में एक महत्वपूर्ण उछाल आया है। उनमें से सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, हाय-सी, एक सेल के जीनोम30 के हर टुकड़े के बीच सभी इंटरैक्शन का नक्शा उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हालांकि, प्रतिबंध खंड स्तर पर महत्वपूर्ण बातचीत का पता लगाने के लिए, हाई-सी अल्ट्रा-डीप अनुक्रमण पर निर्भर करता है, जो व्यक्तिगत जीन के नियामक परिदृश्य का नियमित रूप से अध्ययन करने के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित करता है। इस आर्थिक सीमा को दूर करने के लिए, कई संवर्धन-आधारित 3 सी तकनीकें उभरी हैं, जैसे कि सीएचआईए-पीईटी31, हाइसीएचआईपी 32, और इसके कम-इनपुट समकक्ष हाइक्यूटी33। ये तकनीक एक विशिष्ट प्रोटीन द्वारा मध्यस्थ जीनोम-वाइड इंटरैक्शन के लिए समृद्ध करने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करती हैं। बहरहाल, इन 3 सी तकनीकों की अनूठी विशेषता उनके आवेदन का अभिशाप भी है; उपयोगकर्ता रुचि के प्रोटीन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता पर भरोसा करते हैं और उन स्थितियों की तुलना नहीं कर सकते हैं जिनमें प्रोटीन का बंधन गतिशील है।
प्रमोटर कैप्चर हाई-सी (पीसीएचआई-सी) एक और संवर्धन-आधारित 3 सी तकनीक है जो इन सीमाओंको दरकिनार करती है। बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच संवर्धन प्रणाली को नियोजित करके, पीसीएचआई-सी 28,650 मानव- या 27,595 माउस-एनोटेटेड जीन प्रमोटरों के साथ बातचीत करने वाले जीनोमिक क्षेत्रों के जीनोम-व्यापी उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुस्तकालयों को उत्पन्न करने में सक्षम है, जिसे प्रमोटर इंटरएक्टोम के रूप में भी जाना जाता है। यह दृष्टिकोण सक्रिय और निष्क्रिय प्रमोटरों दोनों के प्रतिबंध टुकड़ा स्तर संकल्प पर महत्वपूर्ण लंबी दूरी की बातचीत का पता लगाने की अनुमति देता है, और हिस्टोन संशोधनों या प्रोटीन बाइंडिंग की गतिशीलता से स्वतंत्र रूप से किसी भी स्थिति के बीच प्रमोटर इंटरैक्शन की तुलना करता है। पीसीएचआई-सी का हाल के वर्षों में व्यापक रूप से सेल भेदभाव 36,37 के दौरान प्रमोटर इंटरएक्टोम पुनर्गठन की पहचान करने, प्रतिलेखन कारकों38,39 की कार्रवाई के तंत्र की पहचान करने और गैर-कोडिंग वेरिएंट 40,41,42,43,44,45 द्वारा रोग में विनियमित नए संभावित जीन और मार्गों की खोज करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।46,47,48, नए ड्राइवर गैर-कोडिंग उत्परिवर्तन49,50 के साथ। इसके अलावा, केवल कैप्चर सिस्टम को संशोधित करके, इस तकनीक को किसी भी इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए जैविक प्रश्न के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एन्हांसर इंटरएक्टोम 51 या गैर-कोडिंग परिवर्तनों के संग्रह का इंटरैक्शन41,52)।
हालांकि, पीसीएचआई-सी तकनीक करने के लिए न्यूनतम 20 मिलियन कोशिकाओं पर निर्भर करता है, जो दुर्लभ कोशिका आबादी के अध्ययन को रोकता है जैसे कि अक्सर विकासात्मक जीव विज्ञान और नैदानिक अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाता है। इस कारण से, हमने कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी) विकसित किया है, जो पीसीएचआई-सी के प्रयोगात्मक ढांचे के आधार पर एक नई लागत प्रभावी और अनुकूलन योग्य विधि है जो कम-सेल इनपुट के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रमोटर इंटरैक्शन उत्पन्न करती है। न्यूनतम ट्यूब परिवर्तनों के साथ प्रयोग करके, मूल पीसीएचआई-सी प्रोटोकॉल से चरणों की अदला-बदली या समाप्त करके, प्रतिक्रिया मात्रा को काफी कम करके, और अभिकर्मक सांद्रता को संशोधित करके, पुस्तकालय जटिलता को अधिकतम किया जाता है और 50,000कोशिकाओं के साथ उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों को उत्पन्न करना संभव है।
कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी) को पीसीएचआई-सी के खिलाफ बेंचमार्क किया गया है और इसका उपयोग मानव हेमटोपोइएटिक सेल भेदभाव के दौरान प्रमोटर इंटरएक्टोम रीवायरिंग को स्पष्ट करने, संभावित नए रोग से जुड़े जीन और गैर-कोडिंग परिवर्तनों द्वारा विनियमित मार्गों की खोज करने और क्रोमोसोमल असामान्यताओं का पता लगाने के लिए किया जाताहै। चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल और तकनीक के माध्यम से विभिन्न गुणवत्ता नियंत्रण यहां पुस्तकालयों की अंतिम पीढ़ी और उनके कम्प्यूटेशनल विश्लेषण तक विस्तृत हैं।
LICHI-C PCHI-C से एक समान प्रयोगात्मक ढांचे का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रमोटर इंटरएक्टोम लाइब्रेरी बनाने की क्षमता प्रदान करता है, लेकिन बहुत कम सेल संख्या के साथ। यह अनावश्यक चरणों को समाप्त करके बहुत प…
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि पर उनकी प्रतिक्रिया के लिए जेवियर प्रयोगशाला के बाकी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम संस्थागत समर्थन के लिए सीईआरसीए कार्यक्रम, जनरलिट डी कैटालोन्या और जोसेप कैरेरस फाउंडेशन को धन्यवाद देते हैं। स्पेनिश विज्ञान और नवाचार मंत्रालय (RTI2018-094788-ए-आई00), यूरोपीय हेमेटोलॉजी एसोसिएशन (4823998), और स्पेनिश एसोसिएशन अगेंस्ट कैंसर (एईसीसी) LABAE21981JAVI द्वारा वित्त पोषित किया गया था। बीएमजे को ला कैक्सा बैंकिंग फाउंडेशन जूनियर लीडर प्रोजेक्ट (एलसीएफ/बीक्यू/पीआई19/11690001) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, एलआर को अगौर एफआई फैलोशिप (2019एफआई-बी00017) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और एलटी-डी को एफपीआई फैलोशिप (PRE2019-088005) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम अपने समर्थन के लिए Universitat Autónoma de बार्सिलोना से जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान पीएचडी कार्यक्रम का धन्यवाद करते हैं। प्रयोगात्मक डिजाइन या पांडुलिपि लेखन में किसी भी बिंदु पर कोई भी फंड शामिल नहीं था।
0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | – | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
HiCUP | 0.8.2 | ||
HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | – | |
PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
SDS – Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |