La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale
Summary
Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un’elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.
Abstract
La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Poiché i motoneuroni sono l’unità finale per eseguire i comportamenti sensomotori, studiare direttamente le risposte elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante della modulazione motoria spinale. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà complesse nel raggiungere questo obiettivo, tra cui il mantenimento della vitalità cellulare, la rapida separazione del midollo spinale dalla struttura ossea e l’utilizzo dell’SCS per indurre con successo potenziali d’azione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che utilizza patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni a SCS con un’elevata risoluzione spaziotemporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere la vitalità cellulare allo stesso tempo per studiare senza problemi il meccanismo elettrico di SCS sul motoneurone ed evitare inutili tentativi ed errori.
Introduction
La stimolazione del midollo spinale (SCS) può ripristinare efficacemente la funzione locomotoria dopo una lesione del midollo spinale (SCI). Andreas Rowald et al. hanno riportato che la SCS consente la funzione locomotoria e del tronco degli arti inferiori entro un solo giorno1. L’esplorazione del meccanismo biologico della SCS per il recupero locomotore è un campo di ricerca critico e di tendenza per lo sviluppo di una strategia SCS più precisa. Ad esempio, il team di Grégoire Courtine ha dimostrato che l’interneurone eccitatorio Vsx2 e i neuroni Hoxa10 nel midollo spinale sono i neuroni chiave per la risposta alla SCS e la neuromodulazione cellulo-specifica è fattibile per ripristinare la capacità di camminare del ratto dopo la lesione midollare2. Tuttavia, pochi studi si concentrano sul meccanismo elettrico della SCS su scala di una singola cellula. Sebbene sia ben noto che lo stimolo in corrente continua soprasoglia può suscitare i potenziali d’azione (AP) nel classico esperimento del calamaro 3,4,5, non è ancora chiaro come la stimolazione elettrica alternata pulsata, come la SCS, influenzi la generazione del segnale motorio.
Data la complessità dei circuiti neurali intraspinali, una selezione appropriata per la popolazione cellulare è importante per studiare il meccanismo elettrico della SCS. Sebbene la SCS ripristini la funzione motoria attivando la via propriocettiva6, i motoneuroni sono l’unità finale per eseguire il comando motorio, derivato dall’integrazione dell’input afferente alle informazioni sulla propriocezione7. Pertanto, studiare direttamente le caratteristiche elettriche dei motoneuroni con SCS può aiutarci a comprendere la logica sottostante alla modulazione motoria spinale.
Come sappiamo, il patch-clamp è il metodo gold standard per la registrazione elettrofisiologica cellulare con una risoluzione spazio-temporale estremamente elevata8. Pertanto, questo studio descrive un metodo che utilizza un patch clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla SCS. Rispetto al cerotto cerebrale9, il cerotto per il midollo spinale è più difficile per i seguenti motivi: (1) Il midollo spinale è protetto dal canale vertebrale con un volume minuscolo, che richiede una micromanipolazione molto fine e una rigorosa manutenzione ghiacciata per ottenere una migliore vitalità cellulare. (2) Poiché il midollo spinale è troppo sottile per essere fissato sul vassoio di taglio, deve essere immerso in agarosio a basso punto di fusione e tagliato dopo la solidificazione.
Quindi, questo metodo fornisce dettagli tecnici nella dissezione del midollo spinale e nel mantenimento della vitalità cellulare allo stesso tempo, in modo da studiare senza problemi il meccanismo elettrico della SCS sui motoneuroni ed evitare inutili prove ed errori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le informazioni di movimento modulate da SCS vengono infine condivise nei motoneuroni. Pertanto, prendere i motoneuroni come obiettivo di ricerca può semplificare il disegno dello studio e rivelare il meccanismo di neuromodulazione della SCS in modo più diretto. Per registrare simultaneamente diverse caratteristiche di stimolo e risposte cellulari, un patch-clamp è un buon metodo per studiare le caratteristiche elettrofisiologiche su scala di singola cellula. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà, tra cui come m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 e 82301657) e dal China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
Riferimenti
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