Summary
Microdrives personalizados permitem a segmentação submilimétrica de locais de gravação corticais com matrizes lineares de silício.
Abstract
O macaco sagui fornece um modelo ideal para examinar circuitos corticais laminares devido à sua superfície cortical lisa, o que facilita gravações com matrizes lineares. O sagui tem crescido recentemente em popularidade devido à sua organização funcional neural semelhante a outros primatas e suas vantagens técnicas para registro e imagem. No entanto, a neurofisiologia neste modelo apresenta alguns desafios únicos devido ao pequeno tamanho e à falta de giros como pontos de referência anatômicos. Usando microdrives personalizados, os pesquisadores podem manipular a colocação de matriz linear para precisão submilimétrica e gravar de forma confiável no mesmo local alvo retinotopicamente ao longo dos dias de gravação. Este protocolo descreve o passo-a-passo da construção do sistema de posicionamento de micro-drive e a técnica de registro neurofisiológico com arranjos lineares de eletrodos de silício. Com o controle preciso da colocação do eletrodo nas sessões de gravação, os pesquisadores podem facilmente atravessar o córtex para identificar áreas de interesse com base em sua organização retinotópica e nas propriedades de sintonia dos neurônios gravados. Além disso, usando este sistema de eletrodos de arranjo laminar, é possível aplicar uma análise de densidade de fonte de corrente (CSD) para determinar a profundidade de registro de neurônios individuais. Este protocolo também demonstra exemplos de gravações laminares, incluindo formas de onda de pico isoladas em Kilosort, que abrangem vários canais nas matrizes.
Introduction
O sagui-comum (Callithrix jacchus) cresceu rapidamente em popularidade como um modelo para estudar a função cerebral nos últimos anos. Essa crescente popularidade deve-se à acessibilidade do córtex liso do sagui, às semelhanças na organização funcional neural com humanos e outros primatas, e ao pequeno tamanho e à rápida taxa de reprodução1. Como este organismo modelo tem crescido em popularidade, tem havido um rápido desenvolvimento nas técnicas neurofisiológicas adequadas para uso no cérebro de sagui. Métodos eletrofisiológicos são amplamente utilizados em neurociência para estudar a atividade de neurônios únicos no córtex de roedores e primatas, resultando em resolução temporal e acesso de localização incomparáveis. Devido à relativa novidade do macaco sagui como modelo da neurociência visual, a otimização das técnicas de eletrofisiologia do comportamento acordado ainda está em evolução. Estudos prévios mostraram o estabelecimento de protocolos robustos para eletrofisiologia em preparações anestesiadas2, e estudos neurofisiológicos com comportamento precoce em vigília mostraram a confiabilidade de electos de tungstênio monocanal3. Nos últimos anos, pesquisadores estabeleceram o uso de arranjos de microeletrodos à base de silício para neurofisiologia do comportamento acordado4. No entanto, o sagui apresenta desafios de mira únicos devido ao seu pequeno tamanho cerebral e à falta de marcos anatômicos. Este protocolo descreve como construir e usar um sistema de gravação de micro-drive adequado para o sagui que permite o registro de grandes populações de neurônios com matrizes lineares de silício enquanto produz dano tecidual mínimo.
Trabalhar com o sagui representa um desafio devido à menor escala dos mapas retinotópicos no córtex visual em comparação com primatas maiores. Um ligeiro deslocamento dos eletrodos em apenas 1 mm pode resultar em mudanças significativas nos mapas. Além disso, os pesquisadores muitas vezes precisam alterar o posicionamento dos eletrodos entre as sessões de gravação para obter uma gama mais ampla de posições retinotópicas no córtex visual. As preparações semicrônicas atuais não permitem o ajuste do posicionamento do eletrodo diariamente ou com precisão suficiente para atingir locais específicos em escalas submilimetradas5. Com isso em mente, o sistema de micro-acionamento proposto utiliza um estágio de eletrodo X-Y que monta um micro-drive leve em uma câmara de gravação e permite o direcionamento submilimétrico de locais corticais. Os componentes móveis do estágio X-Y permitem o movimento vertical e horizontal da matriz linear para atravessar as áreas corticais sistematicamente, o que é necessário para identificar áreas de interesse (via retinotopia e propriedades de sintonia). Nas sessões de gravação, os pesquisadores também podem ajustar manualmente o estágio X-Y para mudar os locais de destino dentro da área. Esta é uma vantagem fundamental em relação a técnicas alternativas que usam preparações de gravação semi-crônicas, que não têm mecanismos fáceis de direcionamento de eletrodos.
O micro-drive é uma ferramenta versátil que permite a fixação de várias matrizes de silício a serem montadas para abaixar no córtex. Neste protocolo, uma sonda personalizada com duas matrizes lineares de 32 canais espaçadas de 200 μm foi usada para a investigação de circuitos laminares abrangendo a profundidade cortical. A maioria dos métodos para sondar os circuitos neurais tipicamente amostram os potenciais elétricos ou unidades únicas médias em todas as camadas do córtex cerebral. No entanto, pesquisas recentes têm revelado achados intrigantes sobre microcircuitos laminares corticais6. Ao utilizar o micro-drive, os pesquisadores podem usar sondas laminares e fazer ajustes finos na profundidade de gravação para garantir uma amostragem abrangente em todas as camadas.
Este sistema pode ser construído com componentes comercialmente disponíveis e é facilmente modificado para diferentes técnicas experimentais ou sondas. As principais vantagens desta preparação são a capacidade de alterar a posição de gravação X-Y com precisão submilimétrica e controlar a profundidade da gravação dentro do córtex. Este protocolo apresenta instruções passo a passo para a construção do microdrive de estágio X-Y e técnicas de registro da neurofisiologia.
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Protocol
Os procedimentos experimentais seguiram o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Os protocolos para os procedimentos experimentais e comportamentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Rochester.
1. Construção do micro-drive contendo o eletrodo para gravação (Figura 1)
NOTA: Os estágios X-Y personalizados que contêm matrizes de silício linear multicanal permitem a segmentação submilimétrica dos locais de gravação.
- Reúna todas as partes da microunidade descritas na Figura 1. Use plástico ABS (Acrilonitrila-butadieno-estireno) transparente para imprimir em 3D as peças personalizadas. Isso inclui a manga protetora, a base, o estágio X e o estágio Y. Projetos para peças 3D estão disponíveis on-line (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). Além disso, reúna o eletrodo, plataforma retangular de plástico, grade, micromanipulador, tubulação de aço e seis parafusos de aço inoxidável (tamanho do parafuso: 00).
- Usando uma ferramenta rotativa com um acessório de corte de roda diamantada, corte uma seção de 4 mm x 3 mm x 3 mm da grade de plástico com espaçamento de furo de 1 mm x 1 mm.
- Use epóxi para fixar a pequena seção de grade recortada no topo do estágio em Y. Em seguida, encaixe o micro-drive sobre essa grade com um parafuso. Adicione epóxi em sua base para estabilidade.
- Conecte a pequena plataforma retangular impressa em 3D a um tubo de aço de 28 G com epóxi. Isso será usado em etapas futuras para segurar o eletrodo de silício.
- Rosqueie um tubo guia de 23 G através da grade. Em seguida, rosqueie o tubo de aço preso à plataforma plástica através do tubo guia de 23 G. Coloque o tubo de aço de 28 G em um dos slots do micro-drive.
- Em seguida, monte as peças 3D (base, estágio X, estágio Y) usando parafusos hexadecimais de aço inoxidável (tamanho: 00, comprimento: 1/8 pol) para construir a base para o acionamento.
- Primeiro, use uma ferramenta de toque manual para tocar os orifícios de parafuso pré-fabricados na base e no estágio X. Em seguida, comece inserindo quatro parafusos através das ranhuras longas no estágio X e prendendo-os aos orifícios de parafuso correspondentes pré-fabricados na base.
- Uma vez que o estágio X móvel é fixado à base, insira dois parafusos através do slot longo no estágio Y e fixe-os aos orifícios de parafuso pré-fabricados no estágio X.
NOTA: Tanto o estágio X quanto o estágio Y devem permanecer móveis até que os parafusos estejam totalmente apertados.
- Certifique-se de que o acionamento do micromanipulador esteja equipado com uma plataforma de plástico para conectar o conector do eletrodo, bem como um tubo de poliimida estendido para segurar o eletrodo. Conecte o conector de 64 pinos à plataforma do micromanipulador usando fita adesiva.
- Coloque cuidadosamente um punhado de bacitracina (pomada estéril) no tubo de plástico no micromanipulador e conecte o eletrodo conectado ao conector de 64 pinos através de um cabo de fita flexível.
- Use o acionamento do micromanipulador para segurar o eletrodo de silício e seu conector enquanto rosqueia o tubo de plástico através de um orifício no estágio Y. O eletrodo ficará pendurado sob o estágio da sonda, aguardando para ser fixado à plataforma retangular plástica (passo 7, seção 1).
- Desconecte o conector de 64 pinos da unidade do micromanipulador e use gel de cola para fixar o conector à plataforma no palco X. Epóxi adicional pode ser adicionado para fortalecer a ligação do conector uma vez que a cola está segurando-o no lugar. Deixe durante a noite secar.
- Retire cuidadosamente o eletrodo do tubo de plástico e remova o acionamento do micromanipulador do conjunto.
NOTA: Neste ponto, a unidade é mantida apenas com o clipe de jacaré de uma Mão Amiga e o eletrodo não está seguro dentro da construção da unidade. - Mova cuidadosamente o clipe do jacaré para virar a unidade para ver o eletrodo não seguro. Usando pinças de ponta romba, coloque o eletrodo no suporte de plástico abaixo do estágio Y e fixe-o com uma pequena quantidade de elastômero de silicone (silástico). Aguarde 5 min até que o adesivo esteja curado.
- Use o controle de parafuso no micro-drive para retrair o eletrodo.
- Coloque a luva protetora sobre o eletrodo no micro-acionamento. Esta capa protetora tem o mesmo tamanho das câmaras de gravação impressas sob medida e se encaixa firmemente na base do conjunto da unidade.
- Usando uma chave de fenda de cabeça plana, aperte os três parafusos localizados lateralmente no componente base do micro-acionamento para fixar a manga protetora no lugar. Conecte o head-stage usado para as gravações ao conector de 64 pinos.
2. Revestimento em politrodo dos eletrodos para reduzir a impedância global (Figura 2)
NOTA: Para obter a melhor qualidade de gravação, é útil plaquear os conjuntos de eletrodos de silício com uma solução de poli(3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT). Foi demonstrado que esse método aumenta a relação sinal-ruído 7,8.
- Para fazer a solução de PEDOT, combinar 0,075 mL de 3,4-etilenodioxitiofeno (EDOT) e 1,4 g de poli(4-estirenosulfonato de sódio) (PSS) em 70 mL de água destilada. Vórtice esta solução brevemente para garantir a dissolução completa dos componentes. Misture esta solução no dia anterior ao uso para a melhor dissolução.
- Depois de iniciar o software do testador de impedância (consulte Tabela de Materiais), prepare as configurações com a preparação do eletrodo escolhido. Usando o menu suspenso superior no canto superior esquerdo da janela do software, selecione o adaptador que está sendo usado (N2T A32). Usando o segundo menu suspenso, selecione o eletrodo que está sendo usado (NLX-EIB-36). Se o eletrodo não estiver listado no menu suspenso, consulte o manual para saber como definir um novo eletrodo. Certifique-se de que o número de canais está correto.
- Conecte a sonda ao sistema de teste de impedância através do conector e abaixe a sonda em soro fisiológico aterrado para obter uma leitura basal.
- No sistema de teste de impedância, pressione o botão Test Impedances no lado esquerdo e verifique as configurações corretas (Configurações: Frequência de teste: 1.004 Hz, Ciclos: 100, Pausa: 0). Em seguida, pressione o botão Test probe no canto inferior direito.
- Uma janela de relatório de teste aparecerá à medida que o testador de impedância for executado, armazenando os resultados em uma planilha. Salve esses resultados para referência futura para ambas as hastes do eletrodo (a montagem do eletrodo em um copo para uso com o testador de impedância está representada na Figura 2D). Se estiver usando uma sonda com várias hastes, verifique se a etapa 3 é repetida para cada haste.
- Remova a sonda do soro fisiológico abaixando o pedestal (ou seja, macaco de laboratório) que segura o béquer. Substitua o líquido do béquer por água destilada. Levante o macaco de laboratório para submergir o eletrodo, enxágue a solução salina restante e, em seguida, abaixe o macaco de laboratório novamente.
- Substitua a água destilada no copo por solução de PEDOT e levante o macaco de laboratório até que o eletrodo fique submerso na solução.
- Selecione o botão DC Electroplate no lado esquerdo da janela do software e verifique se as configurações corretas são usadas (Configurações: Autoplate: 0,004 μA, 350 Hz, Duração: 5, Pausa: 1). Em seguida, pressione o botão Autoplate no canto inferior direito. Mais uma vez, uma janela de relatório de sonda aparecerá com os resultados da galvanoplastia. Salve esses resultados para referência futura. Se estiver usando uma sonda com várias hastes, certifique-se de que essa etapa seja repetida para cada haste.
- Retire a sonda da solução de PEDOT abaixando o macaco de laboratório e lave a sonda com água destilada como realizado anteriormente (passo 4). Após o enxágue, encha o copo com soro fisiológico e levante o macaco de laboratório até que o eletrodo fique submerso.
- Pressione o botão Test Impedances no lado esquerdo da janela do software e verifique se as configurações corretas foram usadas (Configurações: Frequência de teste: 1.004 Hz, Ciclos: 100, Pausa: 0). Pressione o botão Test Probe no canto inferior direito. Salve esses resultados para referência futura. Se estiver usando uma sonda com várias hastes, certifique-se de que essa etapa seja repetida para cada haste.
OBS: Comparar os valores pós-galvanoplastia com os valores pré-galvanvados. Deve haver diminuição dos valores de impedância. - Com o uso contínuo, as sondas podem apresentar aumento nos valores de impedância após 6 meses. Se houver uma preocupação com os valores de impedância do sinal de gravação, teste novamente as impedâncias da sonda seguindo o passo 3. Se os valores de impedância tiverem aumentado em relação aos valores iniciais, repita a galvanoplastia (passo 6).
3. Colocação cirúrgica da calota, câmaras e craniotomia (Figura 3A-C)
OBS: Neste trabalho, ao término do estudo, o animal foi anestesiado em uso de isoflurano e recebeu injeções intramusculares (IM) de cetamina, seguidas de injeção intraperitoneal (IP) de eutasol. O encéfalo foi extraído após perfusão transcárdica com soro fisiológico seguido de formalina a 10%.
- Treinar os saguis (pelo menos 1,5 anos de idade) para se sentarem em uma pequena cadeira de primata seguindo métodos previamente descritos 3,9,10,11 2 meses antes da cirurgia.
- No dia da cirurgia, induzir os indivíduos com uma injeção intramuscular (i.m.) de cetamina (5-15 mg/kg)/dexdormitor (0,02-0,1 mg/kg) (e midazolam a 0,25 mg/kg como relaxante muscular) e confirmar a anestesia adequada com base na frequência cardíaca, respiração e reflexo de pinça dos dedos. Intubar os animais para administração contínua de isoflurano (0,5%-2% em oxigênio a 100%) durante toda a cirurgia, monitorando seus sinais vitais. Use pomada veterinária nos olhos durante a cirurgia para evitar o ressecamento durante a anestesia.
- Depois que os cirurgiões colocarem EPIs estéreis, prepare um campo cirúrgico estéril usando campos estéreis para cobrir as superfícies e o campo operatório. Usando técnicas assépticas, os cirurgiões implantam uma touca de acrílico com pinos e parafusos de titânio para estabilizar a cabeça usando métodos descritos em detalhes anteriormente por Nummela et al.11.
- Durante a cirurgia de implante, planeje a colocação da câmara de registro sobre as áreas de interesse (por exemplo, áreas visuais área temporal média [TM] e córtex visual primário [V1]) com base em coordenadas estereotáxicas12.
- Coloque um fio de aterramento.
- Comece perfurando um orifício de rebarba de 1,1 mm no crânio perto da área da câmara de gravação planejada. Dobre um fio de aço inoxidável 36 G a cerca de 0,075-1 mm da ponta e deslize a porção dobrada do fio entre o crânio e a dura-máter no fundo do orifício da rebarba.
- Inicialmente sele o fio e o furo com cera de osso e depois com cimento e acrílico ao colocar as câmaras. Certifique-se de deixar uma parte externa perto da câmara para fixar para aterramento.
- Depois de colocar uma camada de base de cimento adesivo rápido para cobrir toda a área do local de gravação e fio de aterramento, adera as câmaras de gravação (consistindo de peças impressas em 3D personalizadas) ao crânio usando o cimento adesivo rápido e reforce com acrílico ao construir o implante de cabeça.
- Sele as câmaras com uma tampa de câmara impressa em 3D que é projetada para caber firmemente dentro da câmara (e não pode ser removida por companheiros de gaiola alojados com o sujeito).
- Dispense uma pequena quantidade de elastômero de silicone (silástico) ao redor das bordas internas da câmara usando as pontas de mistura incluídas e, em seguida, insira a tampa da câmara até nivelar com as paredes externas da câmara.
- As câmaras são projetadas com orifícios de acesso (1 mm de diâmetro) em ambos os lados da câmara para garantir que a tampa da câmara possa ser removida facilmente. Use silastic para selar esses orifícios de acesso, resultando em uma vedação hermética da câmara.
NOTA: Para remover as tampas da câmara, use uma pinça para remover o silastic vedando os orifícios de acesso primeiro para quebrar a vedação hermética da câmara. Em seguida, um pino pode ser usado para alavancar a tampa da câmara para fora da câmara.
- Recupere os animais da anestesia e não os deixe sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Tratar os animais no pós-operatório com antibióticos (amoxicilina-ácido clavulânico a 13,75 mg/kg) por 7 dias e anti-inflamatórios (meloxicam a 0,1 mg/kg) por 3 dias. Administrar medicação para dor de liberação lenta antes da recuperação para durar 72 h no pós-operatório e alojar os animais de forma independente até a recuperação completa.
- Duas a três semanas após a cirurgia, comece a treinar o apoio de cabeça e o comportamento visual. Coloque o sagui em uma cadeira de primata e permita a aclimatação ao apoio de cabeça. Uma vez confortável, treine o sagui para realizar várias tarefas básicas, incluindo fixação visual central13 e uma tarefa de sacada em direção a uma grade de Gabor detectada perifericamente, que é usada para medir sua acuidade visual11.
- Após treinamento comportamental suficiente, realizar uma craniotomia dentro da câmara de registro. Sob técnicas estéreis, realizar uma segunda cirurgia para criar uma craniotomia (2-3 mm de diâmetro) na câmara de registro sobre a área de interesse (por exemplo, área MT). Selar a craniotomia com aplicação espessa de silastic de cerca de 1 mm ou a profundidade da craniotomia para proteger o cérebro de infecção e reduzir o crescimento da granulação14. Certifique-se de que o selo de silicone tenha bordas agarradas a pelo menos 2 mm ou mais do cimento dental em todos os lados. Substitua a tampa da câmara conforme descrito na etapa 7.
- Se ocorrer algum sangramento ou o selo de silastic vazar fluidos claros nos dias seguintes à cirurgia, a câmara precisará ser limpa.
- Se o selo de silastic estiver intacto, use técnicas estéreis para limpar com 10% de betadina e lave com soro fisiológico estéril antes de remover o selo. Se o selo de silicone não estiver intacto, limpe-o apenas com soro fisiológico estéril sob técnicas estéreis.
- Uma vez que o silastic é removido, lave a dura-máter com soro fisiológico estéril várias vezes, e seque com um aplicador de ponta de algodão. Seque ainda bem a câmara usando um aplicador de ponta de algodão antes de aplicar uma nova camada de silástico. Normalmente, a câmara se estabiliza e permanece seca com uma vedação apertada após alguns dias a 1 semana.
- Uma vez estabilizada a craniotomia e sem sinais de sangramento, realize um raspado dural para remover o excesso de tecido sobre a dura-máter. Em seguida, aplicar uma fina camada (<1 mm) de silastic (fina o suficiente para permitir a passagem dos eletrodos para registros) e usar uma broca de broca de 1/4 para prender o silastic sobre as paredes da craniotomia, como mostrado na Figura 3C, para aquisição mecânica.
NOTA: Isso também permitirá uma remoção mais fácil para fins de limpeza. O silastic pode permanecer no local durante todo o estudo e pode ser puncionado com eletrodos lineares para registro.
4. Configuração do registro neurofisiológico (Figura 3D-F)
NOTA: As etapas de manejo dos animais variam de acordo com o laboratório e o experimento. Os passos a seguir são específicos para a colocação do micro-drive e a penetração da dura-máter para as gravações.
- Retire a tampa da câmara de registo (descrito no ponto 3, passo 7.2). Coloque a tampa em álcool isopropílico 91% para deixar de molho durante a gravação. Certifique-se de que as bordas da câmara estão limpas de silástico. Se o silastic for deixado nas bordas da câmara, o micro-drive não ficará correto.
- A base do micro-acionamento possui três parafusos para apertá-lo à câmara no animal. Normalmente, esses parafusos são apertados no lugar em torno de uma luva protetora que é do mesmo tamanho da câmara para manter a sonda de silicone dentro protegida de ser atingida.
- Primeiro, use a chave de fenda para soltar os três parafusos que seguram a manga protetora sobre a sonda de silicone e remova cuidadosamente a manga. Conecte o micro-drive à câmara de gravação, tomando cuidado para não atingir os eletrodos de silicone nas paredes da câmara (Figura 3D, E).
- Além disso, certifique-se de que os eletrodos estejam em uma posição totalmente retraída antes de colocar a unidade na câmara, de modo que eles fiquem bem acima do córtex na colocação inicial.
- Uma vez colocado, use a chave de fenda para apertar cada parafuso na lateral do micro-acionamento (Figura 3F). Escolha uma ordem para apertar os parafusos e use-a sempre para manter a estabilidade no local. Os pesquisadores também podem querer contar o número de voltas ao soltar inicialmente os parafusos para apertá-los em uma quantidade semelhante. Verifique se a sonda está solta e aperte-a conforme necessário, mas tenha cuidado para não retirar as roscas do parafuso no plástico apertando demais.
- Uma vez que o micro-acionamento esteja preso à câmara, coloque todos os fios de aterramento necessários.
NOTA: Deixe o head stage inserido no conector durante a noite e insira apenas o cabo de interface periférica serial (SPI) no head stage para gravações, pois é difícil inserir o head stage no conector enquanto ele estiver no animal. - Conecte cuidadosamente o cabo SPI ao estágio principal (já conectado à sonda). Certifique-se de não dobrar o fio. Amplificar e digitalizar todos os dados de neurofisiologia do estágio principal a 30 kHz usando a GUI Open-Ephys (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). Filtro passa-alta o sinal de banda larga do estágio principal a 0,1 Hz. Correto para as mudanças de fase dessa filtragem, conforme descrito anteriormente15. Para matrizes lineares, pré-processe os rastreamentos resultantes por referência de média comum.
- Insira o mapa de canais para o conjunto de eletrodos específico que está sendo usado no sistema de gravação para que os canais plotados durante a gravação sejam ordenados por profundidade na visualização do sinal de gravação filtrada por alta passagem. Esta incidência será utilizada ao avançar e retrair o eletrodo.
5. Realização do experimento de registro neurofisiológico (Figura 4)
NOTA: Aqui, o método para baixar as matrizes de eletrodos no córtex é descrito; Este método foi otimizado para evitar ondulações excessivas do tecido subjacente. Um aumento no ruído nos registros eletrofisiológicos fornece uma boa indicação de ondulação antes de penetrar no silastic e entrar no cérebro. Uma vez no cérebro, se houver muitas ondulações, o pesquisador pode notar unidades se deslocando na sonda mesmo sem a manipulação da unidade (unidades se movendo gradualmente através dos canais em profundidade), ou, alternativamente, o pesquisador pode notar supressão da atividade neural, particularmente em locais superficiais na sonda. Nessas condições, a unidade é retraída para aliviar ondulações e facilitar melhores gravações.
- Usando o controle de parafuso no micro-acionamento, abaixe a sonda de silicone, fazendo uma volta (250 μm) a cada 1-2 s até que as unidades sejam observadas na ponta da matriz.
NOTA: Um pequeno aumento no ruído durante a penetração do silastic colocado sobre a dura-máter pode ser observado. As hastes vão ondular o silastic antes de estourar, o que pode aumentar o ruído na sonda. Uma descida rápida até o primeiro sinal de unidades auxilia na penetração da camada de silástico. - Uma vez que os primeiros neurônios são observados, retrair uma volta do micro-drive (250 μm) para reduzir a velocidade de entrada à medida que o eletrodo começa a estourar através do silastic e da dura-máter no tecido cortical. Se o eletrodo parecer continuar avançando no tecido ao longo do tempo sem micromanipulação, retraia uma volta adicional para aliviar a pressão da sonda empurrando o silastic e o tecido abaixo dele.
NOTA: Deve ser possível rastrear a localização dos neurônios se o mapa de canal correto para a matriz linear tiver sido carregado (os canais aparecerão ordenados por sua profundidade em relação ao córtex). - Continue conduzindo a matriz para o córtex muito lentamente, avançando por aproximadamente quatro a seis voltas (1-1,5 mm) ao longo de uma duração de 20-30 minutos até que os neurônios estejam distribuídos uniformemente em todo o comprimento da sonda.
- Retrair lentamente a matriz por uma a duas voltas (0,25-0,5 mm) para reduzir a pressão sobre o tecido antes de iniciar os registros.
NOTA: Os neurônios normalmente não mudam a localização do canal na matriz linear durante essa retração, sugerindo que ela atua principalmente para reduzir a pressão sobre o tecido. Sem retração, um deslocamento contínuo da matriz pode ser visto durante o registro à medida que o tecido relaxa, interrompendo assim a estabilidade do registro (Figura 4C). - Após a retração, aguarde 20 min antes de iniciar as gravações. Isso limitará a quantidade de movimento visto na gravação. Use esse tempo para se preparar para a gravação (ou seja, calibrar o rastreamento ocular e preparar os sistemas de apresentação do estímulo).
- Selecione Gravar no software de gravação.
- Quando o experimento estiver concluído, selecione o botão de gravação novamente. Isso criará o arquivo de gravação completo no destino selecionado. Verifique se o arquivo foi salvo corretamente antes de continuar.
- Lentamente, comece a retrair a matriz para fora do córtex em uma velocidade semelhante à anterior (quatro a seis voltas em uma duração de 20-30 minutos). Visualize a sonda se retraindo observando os neurônios se deslocarem ao longo da sonda. Depois de se retrair pelo número de voltas desde a primeira visão dos neurônios e quando não forem observados mais neurônios na sonda, continue se retraindo mais rapidamente até retornar à posição inicial totalmente retraída.
- Para remover a sonda da câmara de gravação, execute as etapas 1 a 3 na seção 4 em ordem inversa (ou seja, primeiro execute a etapa 3, seguida pela etapa 2 e, em seguida, a etapa 1).
- Uma vez que a sonda tenha sido removida da câmara de registro, mergulhe-a em solução de lente de contato por 20 minutos para remover qualquer tecido ou sangue do eletrodo. Depois, coloque a sonda em álcool por 1 min para remover a solução da lente de contato e deixe o eletrodo secar.
- Use Kilosort2 para classificar os dados da matriz por pico após a filtragem inicial do sistema de gravação (conforme descrito anteriormente na seção 4, etapa 5).
- Rotule manualmente as saídas dos algoritmos de classificação de pico usando a GUI "phy" (https://github/kwikteam/phy). Classificar as unidades com formas de onda minúsculas ou fisiologicamente implausíveis como ruído e excluí-las.
- Se estiver usando sondas laminares, visualize as formas de onda de pico em cada canal para garantir que unidades únicas sejam rotuladas no canal com a forma de onda de pico (Figura 5A). Inclua apenas unidades que tenham clusters claros no espaço PCA, menos de 1% de violações de intervalo entre picos e formas de onda de pico bifásicas (que devem ser localizadas em canais adjacentes na matriz linear). Um exemplo de unidade única é mostrado na Figura 5B, que exibe clusters claros no espaço da ACP (canto superior direito) e estabilidade ao longo do tempo (canto inferior direito).
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Representative Results
Este protocolo descreve como construir um estágio de eletrodo X-Y (Figura 1) que permite a segmentação submilimétrica de locais e mantém o posicionamento confiável em sessões de gravação separadas. A confiabilidade do posicionamento X-Y é ilustrada na Figura 6, que demonstra que duas sessões de registro realizadas com uma semana de intervalo mostraram sobreposição de 70,8% em suas localizações médias de FR (Figura 6A). Além disso, pequenos ajustes no posicionamento do micro-drive podem suportar movimentos precisos no espaço retinotópico. Pequenos movimentos dos estágios X e Y de até 0,2 mm podem ser feitos fazendo referência aos furos pré-perfurados em cada estágio, que estão separados por 2 mm. Em uma série de sessões de registro que atravessaram a borda MT/MTC usando pequenos ajustes de posicionamento (Figura 6B), movimentos precisos no espaço retinotópico puderam ser vistos (Figura 6C). Os locais de registro do MT e MTC alinharam-se com os mapas eletrofisiológicos anteriormente retratados em Salomão e Rosa2. Da mesma forma, com este protocolo, o posicionamento em Z pode ser rastreado pelo número de voltas até a profundidade do eletrodo preferido. Enquanto o posicionamento Z do acionamento para colocar eletrodos em profundidade cortical deve ser ajustado diariamente e inclui alguma variação, é possível obter estimativas de profundidade em áreas visuais iniciais off-line usando a análise de densidade da fonte de corrente (CSD), como descrito anteriormente16.
Usando essa tecnologia de estágio X-Y, os pesquisadores podem realizar o registro neurofisiológico com matrizes lineares enquanto os sujeitos executam uma variedade de tarefas de forrageamento para mapeamento de campo receptivo visual e tarefas simples de sacade17. As técnicas de colocação dos eletrodos são mostradas na Figura 4, que destaca a importância da retração para aliviar a pressão sobre o tecido e prevenir danos corticais a longo prazo. O uso de duas matrizes lineares de haste permite a amostragem de um grande número de neurônios em profundidades corticais durante cada gravação. Neste trabalho, os dados de matriz ordenada por espículas obtidos usando Kilosort mostraram que as principais características dos componentes de uma seleção de picos em um cluster eram distintas dos picos de fundo e que os registros eram estáveis ao longo do tempo (Figura 5).
Figura 1: Construção do micro-acionamento do eletrodo. A construção de um micro-acionamento de eletrodos é possível após a obtenção de todos os componentes necessários descritos na seção 1, etapa 1. Cada passo sucessivo (seção 1, passos 2-10) mostra uma imagem de antes e depois para auxiliar na visualização das ações necessárias. Essa construção é explicada na íntegra na seção 1 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração de micro-acionamento e galvanoplastia construída. Imagem de visão geral da microunidade concluída na parte superior e inferior (B). (C) O micro-acionamento é acoplado a uma luva protetora (mesmas dimensões das câmaras do implante do animal, com comprimento estendido para proteção) e, em seguida, fixado à câmara do animal apertando três parafusos laterais. (D) Configuração do micro-drive no testador de impedância para galvanoplastia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema da tampa da cabeça e colocação da câmara (A) Representação do desenho de um animal com touca, poste e câmara MT. (B) Imagem de uma câmara de MT 6 meses após a craniotomia e selada com uma fina camada de silástico. (C) Esquema da câmara e preparação do micro-acionamento. A ilustração mostra o preparo da câmara e a fina camada de silastic para uso nas gravações. O micro-acionamento é fixado à câmara de gravação por tensão dos parafusos laterais. (D) Deve-se mover-se paralelamente à câmara para fixar o micro-drive à câmara de gravação. Vir de um ângulo provavelmente resultará em atingir o lado da câmara ou os lados de cimento da craniotomia. (E) O micro-drive fixado em um exemplo de tampa de cabeça. (F) Representação dos três parafusos no micro-acionamento a serem apertados para colocação segura. Nota: Um parafuso fica atrás do conector e geralmente é apertado de cima. Os parafusos são apertados em uma ordem repetível para garantir a confiabilidade da localização da unidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Registros neurofisiológicos (A) Representação do eletrodo antes e depois de tocar a dura-máter (topo). Sinal de gravação filtrado passa-alta de uma única sonda em uma gravação neural antes e depois que a sonda toca a dura-máter (parte inferior). (B) Representação de um eletrodo causando ondulações após estourar inicialmente através do silastic (topo). Sinal de gravação filtrado por alta passagem de uma sonda em uma gravação neural depois que a sonda passou pelo silastic (inferior). Canais com neurônios são rotulados como preenchidos. (C) Representação do eletrodo no córtex antes e após a retração (topo). Sinal de gravação filtrado passa-alta de uma sonda em uma gravação neural antes e depois de uma retração de 500 μm; as unidades deslocaram um canal (inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Pós-processamento dos dados neurofisiológicos. (A) Representação de uma sonda laminar (esquerda) e uma seleção de formas de onda de ponta visualizadas em cada canal (direita). (B) Exemplo de saída Kilosort. (Esquerda) Exemplo de forma de onda em vários canais com uma forma de onda de pico no canal 46. (Canto superior direito) O componente principal apresenta uma seleção de picos no cluster selecionado (azul) contra um conjunto de picos de fundo (uniformemente espaçados no tempo em toda a gravação, cinza). Os aglomerados de picos são facilmente discriminados dos picos de fundo. (Canto inferior direito) A amplitude de uma seleção de picos pertencentes ao cluster selecionado ao longo do tempo. As gravações mostram estabilidade ao longo do tempo para este neurônio de exemplo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Confiabilidade do posicionamento do estágio X-Y (A) Contornos médios do campo receptivo (RF) para duas sessões de gravação com intervalo de 1 semana com as mesmas coordenadas do micro-drive, mostrando 70,8% de sobreposição. (B) Um mapa MT/MTC mostrando os locais de segmentação sucessivos ao longo das sessões de gravação. As linhas sólidas e os números indicam excentricidade da fóvea em graus. As linhas tracejadas indicam o meridiano horizontal (HM). As linhas em negrito indicam o meridiano vertical (VM). (C) Os locais de RF correspondentes para cada haste delineada com um círculo marcando a localização central mostram que pequenos ajustes no posicionamento do micro-drive podem suportar um movimento preciso no espaço retinotópico. O Painel B foi adaptado com permissão de Salomão e Rosa2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vários métodos (por exemplo, crônico, semicrônico, agudo) estão atualmente disponíveis para a realização de experimentos de neurofisiologia em primatas não humanos. O sagui-comum apresenta desafios únicos para experimentos de neurofisiologia devido ao seu pequeno tamanho e à falta de giros como marcos anatômicos. Isso requer que os pesquisadores usem pontos de referência neurofisiológicos, como a retinotopia e as propriedades de sintonia de áreas de interesse, para identificar os alvos de registro. Portanto, ao mapear inicialmente uma área cortical, ajustes diários no posicionamento do eletrodo podem ser necessários. As preparações atuais para neurofisiologia do sagui frequentemente utilizam o posicionamento semicrônico da sonda, o que não permite mecanismos de posicionamento de fácil acesso5. Este protocolo demonstra um micro-drive leve para gravações de matriz linear estável que permite um posicionamento flexível com movimentos submilimétricos precisos ao longo das sessões para mapear a retinotopia dentro de uma câmara.
A abordagem atual, que envolve penetrações diárias agudas de eletrodos para direcionamento e movimentação precisos de eletrodos através de mapas retinotópicos, difere dos implantes crônicos de arranjo de eletrodos em saguis5. No entanto, as preparações agudas intrinsecamente têm desvantagens, como um aumento do tempo de preparação experimental e um risco aumentado de infecção, bem como um risco aumentado de dano ao tecido cortical devido a penetrações repetidas. Embora o uso de silastic tenha sido otimizado nesta preparação para limitar o risco de infecção, a aplicação do silastic requer alguma solução de problemas para garantir que seja feita corretamente e para obter uma vedação seca. Essa preparação também exige cuidados para evitar danos ao eletrodo durante a montagem do acionamento e requer cuidado no aperto dos parafusos de acionamento para garantir o direcionamento confiável em todas as sessões.
Danos corticais a longo prazo podem ser evitados nesta preparação quando aplicada corretamente com uma unidade segura, penetração lenta do tecido, e a evitar os principais vasos sanguíneos. Além disso, o uso de silastic na craniotomia para prevenir infecções tem sido otimizado nessa técnica. O cérebro é coberto com uma fina camada de silastic após a realização da craniotomia para prevenir infecção e manter o interior da câmara seco14. Quando a dura-máter está livre do sangue e do tecido de granulação (o que é possível com um selo de silicone apertado), isso permite a visualização dos principais vasos sanguíneos no tecido subjacente e para direcionar as sondas de silício para evitar atingir os vasos sanguíneos durante os registros. Esta técnica requer alguma solução de problemas durante o aprendizado, uma vez que é fundamental que a vedação do silastic seja fina (<1 mm) no centro para permitir a penetração do eletrodo sem ondulações excessivas, além de ser espessa nas bordas para proporcionar a compra mecânica. Esses métodos serão valiosos na investigação do papel das camadas do córtex do sagui e na prevenção de danos teciduais durante múltiplas penetrações.
Usando componentes de plástico impressos sob medida, juntamente com suprimentos disponíveis comercialmente, este projeto de micro-unidade é fácil de usar uma vez fabricado e pode ser personalizado para diferentes sondas de gravação. Embora esse método tenha se mostrado confiável, a fabricação inicial pode ser difícil e cara de aprender. No entanto, os componentes da sonda são relativamente econômicos de comprar e, uma vez construídos, as sondas demonstraram durar até 1 ano com uso contínuo.
Uma das principais vantagens dessa preparação é o direcionamento preciso e repetível de áreas de interesse devido ao estágio X-Y. Com essa tecnologia, os pesquisadores são capazes de mapear os locais retinotópicos dentro das câmaras de gravação e registrar de diferentes áreas ao longo dos dias usando um sistema de coordenadas. Para conseguir isso, é fundamental garantir o posicionamento correto da sonda diariamente e apertar todos os parafusos externos de maneira repetível. Mudanças na estanqueidade externa do parafuso podem levar a pequenas mudanças na colocação do eletrodo ao longo dos dias.
Registros agudos oferecem o benefício de medições independentes repetidas e podem resultar em um maior rendimento de dados de unidade única. No entanto, gravações semicrônicas ou crônicas também podem oferecer vantagens. Em pequenos animais, como camundongos, registros crônicos podem ser feitos com sondas de silício de alta densidade para obter registros populacionais estáveis e de longo prazo ao longo de vários dias18. Eliminar as inserções repetidas de eletrodos no cérebro para cada sessão de gravação pode encurtar o tempo total de preparação experimental e reduzir o risco de infecção ou dano ao tecido cortical. Portanto, ao avaliar o uso de preparações de registro crônico ou agudo, é essencial considerar os requisitos experimentais específicos.
O projeto de micro-drive proposto permite a flexibilidade de diferentes técnicas de gravação e uso de arrays, o que significa que poderia ser facilmente adotado em configurações experimentais e tubulações existentes. Além disso, a flexibilidade da montagem do array no micro-drive pode levar a possíveis aplicações futuras, como o controle de estimulação a laser para fins optogenéticos. Este método pode permitir que estudos futuros melhorem o direcionamento para estimulação a laser no saguis.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) grant R01 EY030998 (J.F.M., A.B., e S.C.). Esse método é baseado em métodos desenvolvidos em Coop et al (em revisão, 2022; https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.11.511827v2.abstract). Gostaríamos de agradecer a Dina Graf e aos membros do laboratório Mitchell pela ajuda com o cuidado e manuseio do sagui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4 Hp burr drill bit | McMaster & Carr | Cat# 43035A32 | Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits) |
| 1x1mm Crist Grid | Crist Instruments | 1 mm x 1 mm Grid | https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids |
| 91% isopropyl alcohol | Medline | N/A | https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol |
| Acquisition Board | Open-Ephys | N/A | https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1 |
| Bacitracin Ointment | Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc | N/A | https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr |
| Blunt straight Forceps | Medline | N/A | https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products |
| Bone wax | Medline | ETHW31G | https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax |
| C&B Metabond Quick Adhesive Cement System | Parkell, Inc. | SKU: S380 | https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System |
| Clavamox | MWI Animal Health | N/A | |
| Contact lens solution | Bausch and lomb | Various sources available | |
| Custom Printed 3D printed parts | ProtoLab | https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html | |
| DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector | Various Sources | DB25-G2 25 | DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector |
| diamond saw attachment for dremel | Dremel | 545 Diamond Wheel | https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab |
| Digitizing Head-stages | Intan | RHD 32channel (Part #C3314) | https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781 |
| EDOT | Sigma Aldrich | Product # 483028 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028 |
| Helping Hands | Harbor Freight | N/A | https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html |
| Hook Electrical Clips | Various Sources | N/A | Hook test Cable wires |
| Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable) | Intan | Part #C3213 | https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html |
| Lab jack | Various Sources | N/A | https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1 |
| Meloxicam | MWI Animal Health | N/A | |
| Micro-drive | Crist Instrument | 3-NRMD | https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd |
| Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector | NeuroNexus | A1x32-5mm-25-177 | https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/ |
| NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel | NeuraLynx | ADPT-NZ-N2T-32 | https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32 |
| NanoZ System | Plexon | NanoZ Impedance Tester | https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/ |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | Stereotaxic Micromanipulator | https://usa.narishige-group.com/ |
| Open-Ephys GUI | Open-Ephys | https://open-ephys.org/ | |
| Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 ) | Various Sources (Chamfr) | Chamfr Cat#HPC01895 | https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/ |
| Primate Chair | Custom made by University of Rochester Machine Shop | Designs online | https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) | Sigma Aldrich | Product # 243051 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051 |
| RHD USB Interface board | Intan | RHD2000 Evaluation Board Version 1.0 | https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html |
| Silastic gel | World Precision Instruments | # KWIK-SIL | Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive) |
| Slow release buprenorphine | Compounding Pharmacy | ||
| Stainless steel wire 36 gauge | McMaster & Carr | Cat# 6517K11 | Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter |
| Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set | Stanley | 1.4mm flathead screwdriver | https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3 |
| Steel Screws | McMaster & Carr | type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length | https://www.mcmaster.com/ |
| Steel Tube | McMaster & Carr | 28 gauge stainless steel tubing | https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/ |
| Superglue | Loctite | SuperGlue Gel Control | https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html |
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