Endotelyal-mezenkimal geçiş çalışması için yenidoğan heterotopik sıçan kalp nakli modeli
Summary
Bu çalışma, kritik aort darlığı veya hipoplastik sol kalp sendromu gibi konjenital kardiyak defektlerde görüldüğü gibi, endotelyal-mezenkimal geçişe bağlı fibrozun bir hayvan modelini sunar, bu da ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesine, düzenleyici sinyal yollarının tanımlanmasına ve tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır.
Abstract
Subendokardiyal doku birikimi ile tanımlanan endokardiyal fibroelastoz (EFE), sol ventrikül (LV) gelişimi üzerinde önemli etkilere sahiptir ve konjenital kritik aort darlığı ve hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) olan hastaların küratif anatomik biventriküler cerrahi onarımını engeller. Cerrahi rezeksiyon şu anda mevcut tek terapötik seçenektir, ancak EFE sıklıkla tekrarlar, bazen komşu miyokarda daha da infiltratif bir büyüme paterni ile.
EFE’nin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak ve terapötik stratejileri araştırmak için klinik öncesi testlere uygun bir hayvan modeli geliştirilmiştir. Hayvan modeli, EFE’nin olgunlaşmamış kalbin bir hastalığı olduğunu ve klinik gözlemlerle desteklendiği gibi akış bozuklukları ile ilişkili olduğunu dikkate alır. Bu nedenle, yenidoğan sıçan donör kalplerinin heterotopik kalp nakli bu modelin temelidir.
Bir yenidoğan sıçan kalbi, bir ergen sıçanın karnına nakledilir ve alıcının infrarenal aortuna ve inferior vena kavasına bağlanır. Koroner arterlerin perfüzyonu donör kalbin canlılığını korurken, LV içindeki akış durgunluğu çok olgunlaşmamış kalpte EFE büyümesini indükler. EFE oluşumunun altında yatan mekanizma, endokardiyal endotel hücrelerinin, kapakların ve septanın erken embriyonik gelişiminin iyi tanımlanmış bir mekanizması olan ve aynı zamanda kalp yetmezliğinde fibrozisin önde gelen nedeni olan mezenkimal hücrelere (EndMT) geçişidir. EFE oluşumu transplantasyondan sonraki günler içinde makroskopik olarak gözlenebilir. Transabdominal ekokardiyografi, greft canlılığını, kontraktilitesini ve anastomozların açıklığını izlemek için kullanılır. Ötenaziyi takiben, EFE dokusu alınır ve HLHS hastalarından alınan insan EFE dokusu ile aynı histopatolojik özellikleri gösterir.
Bu in vivo model, kalpte EFE gelişim mekanizmalarının incelenmesine ve bu patolojik doku oluşumunu önlemek için tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır ve EndMT ile indüklenen fibrozisin daha genel bir incelemesi için fırsat sağlar.
Introduction
Subendokardiyal dokuda kollajen ve elastik liflerin birikmesiyle tanımlanan endokardiyal fibroelastoz (EFE), inci veya opak kalınlaşmış bir endokard olarak ortaya çıkar; EFE, fetal dönemde ve erken bebeklik döneminde en aktif büyümeye uğrar1. Bir otopsi çalışmasında, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) olan vakaların %70’i EFE2 varlığı ile ilişkilendirilmiştir.
Fibroblastlar için belirteçleri eksprese eden hücreler, EFE’deki ana hücre popülasyonudur, ancak bu hücreler aynı zamanda bu EFE hücrelerinin kökeninin bir göstergesi olan endokardiyal endotelyal belirteçleri de eksprese eder. Grubumuz daha önce EFE oluşumunun altında yatan mekanizmanın, endotelyal-mezenkimal geçiş (EndMT) yoluyla endokardiyal endotel hücrelerinin fibroblastlara fenotipik bir değişimini içerdiğini tespit etmiştir3. EndMT, farklılaşma kümesi (CD) 31 veya vasküler endotelyal (VE)-kaderin (CD144) ve fibroblast belirteçleri (örneğin, alfa-düz kas aktini, α-SMA) gibi endotelyal belirteçler için immünohistokimyasal çift boyama kullanılarak tespit edilebilir. Ayrıca, daha önce SLUG, SNAIL ve TWIST3 transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu ile TGF-ß yolunun bu süreçteki düzenleyici rolünü de belirlemiştik.
EndMT, embriyonik kardiyak gelişim sırasında meydana gelen ve endokardiyal yastıklardansepta ve kapakçıkların oluşumuna yol açan fizyolojik bir süreçtir 4, ancak aynı zamanda kalp yetmezliği, böbrek fibrozu veya kanserde organ fibrozuna neden olur ve vasküler aterosklerozda anahtar rol oynar 5,6,7,8. Kardiyak fibrozda EndMT, biz ve diğerlerininbildirdiği gibi, esas olarak TGF-β yolu ile düzenlenir 3,9. EndMT’yi indüklemek için çeşitli uyaranlar tanımlanmıştır: inflamasyon10, hipoksi 11, mekanik değişiklikler12 ve intrakaviter kan akışındakideğişiklikler 13 dahil olmak üzere akış bozuklukları ve EndMT ayrıca genetik bir hastalığın14 sonucu olabilir.
Bu hayvan modeli, olgunlaşmamışlık ve intrakaviter kan akışındaki değişiklikler, özellikle akış durgunluğu olan kardiyak EFE gelişiminin temel bileşenleri kullanılarak geliştirilmiştir. Yenidoğan sıçanlarının doğumdan hemen sonra gelişimsel olarak olgunlaşmamış oldukları bilindiğinden, olgunlaşmamışlık yenidoğan sıçan kalplerinin donör olarak kullanılmasıyla yerine getirildi. Heterotopik kalp nakli, intrakaviter akım kısıtlamasısağlanmasını önerdi 15.
Klinik açıdan bakıldığında, bu hayvan modeli, EndMT’nin büyüyen sol ventrikül (LV) üzerindeki etkisinin daha iyi araştırılmasına olanak tanır. EndMT ile indüklenen EFE oluşumu16 yoluyla fetal ve neonatal kalbe uygulanan büyüme kısıtlaması, konjenital kritik aort darlığı ve hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) gibi sol ventrikül çıkış yolu tıkanıklıkları (LVOTO) olan hastaların küratif anatomik biventriküler cerrahi onarımdan17 etkilenmesini engellemektedir. Bu hayvan modeli, EndMT aracılığıyla hücresel mekanizmaların incelenmesini ve doku oluşumunun düzenlenmesini kolaylaştırır ve farmakolojik tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır 3,18.
Transabdominal ekokardiyografi, greft canlılığını, kontraktilitesini ve anastomozların açıklığını izlemek için kullanılır. Ötenazi sonrası 3 gün içinde makroskopik olarak EFE oluşumu gözlenebilir. EFE dokusu, LVOTO’lu hastalardan alınan insan EFE dokusu ile aynı histopatolojik özellikleri gösterir.
Bu nedenle, bu hayvan modeli, HLHS spektrumunda pediatrik kullanım için geliştirilmiş olsa da, EndMT’nin moleküler mekanizmasına dayalı çeşitli hastalıklar incelenirken uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yenidoğan donör sıçan kalbinin alıcının karnına heterotopik transplantasyonuna ilişkin bu hayvan modeli, ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesi yoluyla EndMT kaynaklı fibrozu inceleme, düzenleyici sinyal yollarını belirleme ve tedavi seçeneklerini test etme imkanı yaratır. EndMT, kalbin fibrotik hastalıklarının altında yatan mekanizma olduğundan, bu model pediatrik kalp cerrahisi alanında ve ötesinde büyük değere sahiptir. Bu modelde, birçok faktör prosedürün sonucunu olumsuz yönde e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ek Girişimler – Tek Ventrikül Araştırma Fonu (SVRF) ve Tek Ventrikül Genişletme Fonu (I.F.) ve Avusturya Federal Eğitim, Bilim ve Araştırma Bakanlığı BMBWFC (G.G.’ye) tarafından sağlanan fonlardan OeAD-GmbH’nin Marietta Blau bursu tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
Riferimenti
- Lurie, P. R. Changing concepts of endocardial fibroelastosis. Cardiology in the Young. 20 (2), 115-123 (2010).
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Ricerca sul cancro. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 565-577 (2018).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
