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Biologia

Génération de lignées cellulaires knock-out Protein-E CENP-E-/- associées au centromère à l’aide du système CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Cet article rapporte la construction de cellules knock-out de la protéine E associée au centromère (CENP-E) à l’aide du système CRISPR/Cas9 et de trois stratégies de criblage basées sur le phénotype. Nous avons utilisé la lignée cellulaire knock-out CENP-E pour établir une nouvelle approche visant à valider la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E, ce qui est utile pour le développement de médicaments et la recherche biologique.

Abstract

Le système CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 est apparu comme un outil puissant pour une édition de gènes précise et efficace dans une variété d’organismes. La protéine E associée au centromère (CENP-E) est une kinésine dirigée vers l’extrémité positive nécessaire à la capture des kinétochores-microtubules, à l’alignement des chromosomes et au point de contrôle de l’assemblage du fuseau. Bien que les fonctions cellulaires des protéines CENP-E aient été bien étudiées, il a été difficile d’étudier les fonctions directes des protéines CENP-E à l’aide de protocoles traditionnels, car l’ablation de CENP-E conduit généralement à l’activation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau, à l’arrêt du cycle cellulaire et à la mort cellulaire. Dans cette étude, nous avons complètement éliminé le gène CENP-E dans les cellules HeLa humaines et réussi à générer les cellules CENP-E-/- HeLa à l’aide du système CRISPR/Cas9.

Trois stratégies de criblage optimisées basées sur le phénotype ont été établies, y compris le criblage des colonies cellulaires, les phénotypes d’alignement des chromosomes et les intensités fluorescentes des protéines CENP-E, qui améliorent efficacement l’efficacité du criblage et le taux de réussite expérimentale des cellules knock-out CENP-E . Il est important de noter que la délétion CENP-E entraîne un désalignement des chromosomes, la localisation anormale des protéines sérine/thréonine kinase B (BubR1) du point de contrôle mitotique BUB1 et des défauts mitotiques. De plus, nous avons utilisé le modèle de cellules HeLa knock-out CENP-E pour développer une méthode d’identification des inhibiteurs spécifiques de CENP-E.

Dans cette étude, une approche utile pour valider la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E a été établie. De plus, cet article présente les protocoles d’édition du génome CENP-E à l’aide du système CRISPR/Cas9, qui pourrait être un outil puissant pour étudier les mécanismes de CENP-E dans la division cellulaire. De plus, la lignée cellulaire knock-out CENP-E contribuerait à la découverte et à la validation des inhibiteurs de CENP-E, qui ont des implications importantes pour le développement de médicaments antitumoraux, les études des mécanismes de division cellulaire en biologie cellulaire et les applications cliniques.

Introduction

L’édition du génome par ingénierie médie les modifications ciblées des gènes dans une variété de cellules et d’organismes. Chez les eucaryotes, la mutagénèse spécifique au site peut être introduite par l’application de nucléases spécifiques à la séquence qui stimulent la recombinaison homologue de l’ADNcible 1. Ces dernières années, plusieurs technologies d’édition du génome, notamment les nucléases à doigts de zinc (ZFN)2,3, les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN)4,5 et les méganucléases à tête chercheuse 6,7, ont été conçues pour cliver les génomes à des sites spécifiques, mais ces approches nécessitent une ingénierie complexe des protéines et des procédures expérimentales redondantes. Des études ont montré que le système CRISPR/Cas (procaryotes de type II) est une technologie efficace d’édition de gènes, qui médie spécifiquement le clivage de l’ADN guidé par l’ARN et spécifique au site dans une grande variété de cellules et d’espèces 8,9,10,11. La technologie d’inactivation des gènes CRISPR/Cas9 a révolutionné les domaines de la biologie fondamentale, de la biotechnologie et de la médecine12.

Les bactéries et la plupart des archées ont développé un système immunitaire adaptatif basé sur l’ARN qui utilise les protéines CRISPR et Cas pour identifier et détruire les virus et les plasmides13. Streptococcus pyogenes L’endonucléase Cas9 (SpCas9) contient le résolvase de jonction de Holliday (RuvC) de type RuvC et le domaine His-Asn-His (HNH), qui peuvent servir efficacement de médiateurs pour les cassures double brin (DSB) spécifiques à la séquence en fournissant un ARN monoguide synthétique (ARNsg) contenant des ARN CRISPR (ARNcr) et un ARNcr trans-activateur (ARNtracr)14,15,16. Les DSB peuvent être réparées par la voie de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) ou de réparation dirigée par homologie (HDR), qui introduit de multiples mutations, y compris des insertions, des délétions ou des substitutions de nucléotides uniques sans cicatrice, dans les cellules de mammifères 1,8. La voie NHEJ sujette aux erreurs et la voie HDR haute fidélité peuvent être utilisées pour médier l’inactivation génique par des insertions ou des suppressions, ce qui peut provoquer des mutations par décalage de cadre et des codons d’arrêt prématurés10.

La kinésine-7 CENP-E est nécessaire à la fixation des kinétochores-microtubules et à l’alignement des chromosomes pendant la division cellulaire 17,18,19. La micro-injection d’anticorps20,21, la déplétion de l’ARNsi 22,23, l’inhibition chimique 24,25,26 et la délétion génétique 27,28,29 de CENP-E entraînent un désalignement chromosomique, l’activation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau et des défauts mitotiques, ce qui entraîne une aneuploïdie et une instabilité chromosomique 19,30. Chez la souris, la délétion de CENP-E entraîne un développement anormal et une létalité embryonnaire aux tout premiers stades du développement 27,29,31. La délétion génétique de CENP-E entraîne généralement un désalignement chromosomique et la mort cellulaire 26,27,29, ce qui constitue un obstacle à l’étude des fonctions et des mécanismes des protéines CENP-E.

Une étude récente a établi une lignée cellulaire conditionnelle de knock-out CENP-E à l’aide d’une méthode d’édition de gènes CRISPR/Cas9 inductible par l’auxine32, qui permet une dégradation rapide des protéines CENP-E dans un temps relativement court33. Cependant, à ce jour, des lignées cellulaires stables de CENP-E knock-out n’ont pas été établies, ce qui constitue un défi technique non résolu en biologie de CENP-E. Compte tenu de la robustesse génétique34, des réponses de compensation génétique 35,36,37 et des environnements intracellulaires complexes, comme les conséquences directes de la délétion complète de CENP-E peuvent être complexes et imprévisibles, il est important d’établir des lignées cellulaires knock-out CENP-E pour l’étude des mécanismes d’alignement des chromosomes, du point de contrôle de l’assemblage du fuseau et des voies de signalisation en aval.

La découverte et les applications des inhibiteurs de CENP-E sont importantes pour le traitement du cancer. À ce jour, sept types d’inhibiteurs de CENP-E ont été trouvés et synthétisés, notamment GSK923295 et ses dérivés24,25, PF-277138,39, dérivés d’échafaudage imidazo[1,2-a]pyridine40,41, composé A42,43, syntelin 44,45, UA6278446 et dérivés de benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole47. Parmi ces inhibiteurs, GSK923295 est un inhibiteur allostérique et efficace de CENP-E qui se lie au domaine moteur de CENP-E et inhibe l’activité de l’ATPase stimulée par les microtubules CENP-E avec un Ki de 3,2 ± 0,2 nM24,25. Cependant, par rapport aux effets inhibiteurs de la GSK923295 sur les cellules cancéreuses en culture, les effets thérapeutiques de la GSK923295 chez les patients cancéreux cliniques ne sont pas idéaux48,49, ce qui a également soulevé des inquiétudes quant à la spécificité de GSK923295 pour CENP-E. De plus, la spécificité et les effets secondaires d’autres inhibiteurs de CENP-E sur les protéines CENP-E sont des questions clés dans la recherche sur le cancer.

Dans cette étude, nous avons complètement éliminé le gène CENP-E dans les cellules HeLa à l’aide du système CRISPR/Cas9. Trois stratégies de criblage optimisées basées sur le phénotype ont été établies, y compris le criblage des colonies cellulaires, les phénotypes d’alignement des chromosomes et les intensités fluorescentes des protéines CENP-E, afin d’améliorer l’efficacité du criblage et le taux de réussite de l’édition du gène CENP-E. De plus, les lignées cellulaires knock-out CENP-E peuvent être utilisées pour tester la spécificité des composés candidats pour CENP-E.

Protocol

1. Construction des vecteurs d’inactivation du gène CRISPR/Cas9 Sélectionner la séquence d’ADN génomique cible sur le gène CENP-E humain (numéro d’enregistrement GenBank. NM_001286734.2) et concevoir l’ARNsg à l’aide d’un outil de conception CRISPR en ligne (http://crispor.tefor.net/). Entrez une seule séquence génomique, sélectionnez le génome de « Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs)?…

Representative Results

Les cellules CENP-E-/- HeLa ont été générées avec succès à l’aide du système CRISPR/Cas9 (Figure 1). La chronologie et les étapes expérimentales critiques de cette méthode sont illustrées à la figure 1. Tout d’abord, nous avons conçu et synthétisé les sgRNA spécifiques de CENP-E, recuit et ligaturé les sgRNA dans le plasmide pX458, transfecté le plasmide dans des cellules HeLa et les avons cultivés pendant 48 …

Discussion

La kinésine-7 CENP-E est un régulateur clé de l’alignement des chromosomes et du point de contrôle de l’assemblage du fuseau pendant la division cellulaire 17,19,20. La délétion génétique de CENP-E entraîne généralement l’activation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau, l’arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire 27,29,51,52.</…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions tous les membres du laboratoire de cytosquelette de l’Université médicale du Fujian pour leurs discussions utiles. Nous remercions Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin et Min-Xia Wu du Centre de services technologiques publics de l’Université médicale du Fujian pour leur assistance technique. Nous remercions Si-Yi Zheng, Ying Lin et Qi Ke du Centre d’enseignement expérimental des sciences médicales fondamentales de l’Université médicale du Fujian pour leur soutien. Cette étude a été soutenue par les subventions suivantes : Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de subvention 82001608 et 82101678), Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (numéro de subvention 2019J05071), Fonds conjoints pour l’innovation de la science et de la technologie, province du Fujian, Chine (numéro de subvention 2021Y9160), et Projet de financement de démarrage de la recherche scientifique sur les talents de haut niveau de l’Université médicale du Fujian (numéro de subvention XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
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Riferimenti

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Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
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