Dit artikel rapporteert de constructie van centromeer-geassocieerde proteïne-E (CENP-E) knock-outcellen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem en drie op fenotype gebaseerde screeningstrategieën. We hebben de CENP-E knock-out cellijn gebruikt om een nieuwe benadering vast te stellen om de specificiteit en toxiciteit van de CENP-E-remmers te valideren, wat nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en biologisch onderzoek.
Het CRISPR-systeem (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 systeem is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor nauwkeurige en efficiënte genbewerking in een verscheidenheid aan organismen. Centromeer-geassocieerd eiwit-E (CENP-E) is een plus-end-gerichte kinesine die nodig is voor het vangen van kinetochoor-microtubuli, chromosoomuitlijning en controlepunt van de spoelassemblage. Hoewel de cellulaire functies van de CENP-E-eiwitten goed zijn bestudeerd, was het moeilijk om de directe functies van CENP-E-eiwitten te bestuderen met behulp van traditionele protocollen, omdat CENP-E-ablatie meestal leidt tot activering van het controlepunt van de spoelassemblage, stopzetting van de celcyclus en celdood. In deze studie hebben we het CENP-E-gen in menselijke HeLa-cellen volledig uitgeschakeld en met succes de CENP-E-/- HeLa-cellen gegenereerd met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem.
Er werden drie geoptimaliseerde op fenotypen gebaseerde screeningstrategieën vastgesteld, waaronder screening van celkolonies, fenotypes van chromosoomuitlijning en de fluorescerende intensiteiten van CENP-E-eiwitten, die de screeningsefficiëntie en het experimentele slagingspercentage van de CENP-E-knock-outcellen effectief verbeteren. Belangrijk is dat CENP-E-deletie resulteert in chromosoommislijning, de abnormale locatie van de BUB1 mitotische checkpoint serine/threonine kinase B (BubR1)-eiwitten en mitotische defecten. Verder hebben we het CENP-E knock-out HeLa-celmodel gebruikt om een identificatiemethode voor CENP-E-specifieke remmers te ontwikkelen.
In deze studie is een bruikbare benadering vastgesteld om de specificiteit en toxiciteit van CENP-E-remmers te valideren. Bovendien presenteert dit artikel de protocollen van CENP-E-genbewerking met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem, wat een krachtig hulpmiddel zou kunnen zijn om de mechanismen van CENP-E in celdeling te onderzoeken. Bovendien zou de CENP-E knock-out cellijn bijdragen aan de ontdekking en validatie van CENP-E-remmers, die belangrijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van antitumorgeneesmiddelen, studies van celdelingsmechanismen in de celbiologie en klinische toepassingen.
Gemanipuleerde genoombewerking bemiddelt de gerichte modificaties van genen in een verscheidenheid aan cellen en organismen. In eukaryoten kan plaatsspecifieke mutagenese worden geïntroduceerd door de toepassing van sequentiespecifieke nucleasen die homologe recombinatie van doelwit-DNAstimuleren 1. In de afgelopen jaren zijn verschillende genoombewerkingstechnologieën, waaronder zinkvingernucleasen (ZFN’s)2,3, transcriptieactivatorachtige effectornucleasen (TALEN’s)4,5 en homing-meganucleasen 6,7, ontwikkeld om genomen op specifieke plaatsen te splitsen, maar deze benaderingen vereisen complexe eiwitengineering en overbodige experimentele procedures. Studies hebben aangetoond dat het type II prokaryotisch geclusterde regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)/Cas-systeem een efficiënte genbewerkingstechnologie is, die specifiek RNA-geleide, plaatsspecifieke DNA-splitsing bemiddelt in een grote verscheidenheid aan cellen en soorten 8,9,10,11. De CRISPR/Cas9-gen-knock-outtechnologie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van basisbiologie, biotechnologie en geneeskunde12.
Bacteriën en de meeste archaea hebben een op RNA gebaseerd adaptief immuunsysteem ontwikkeld dat CRISPR- en Cas-eiwitten gebruikt om virussen en plasmiden te identificeren en tevernietigen. Pyogenes van Streptococcus Cas9 (SpCas9) endonuclease bevat het RuvC-achtige Holliday junction resolvase (RuvC) en His-Asn-His (HNH) domein, dat sequentiespecifieke, dubbelstrengs breuken (DSB’s) efficiënt kan mediëren door een synthetisch single-guide RNA (sgRNA) te leveren dat CRISPR-RNA’s (crRNA) en transactiverend crRNA (tracrRNA) bevat14,15,16. DSB’s kunnen worden gerepareerd via de indelvormende niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of homologiegerichte reparatie (HDR)-route, die meerdere mutaties introduceert, waaronder inserties, deleties of littekenloze substituties met één nucleotide, in zoogdiercellen 1,8. Zowel de foutgevoelige NHEJ als de high-fidelity HDR-route kunnen worden gebruikt om gen-knock-out te mediëren door inserties of deleties, wat frameshift-mutaties en voortijdige stopcodons kan veroorzaken10.
Kinesine-7 CENP-E is vereist voor de aanhechting van kinetochoor-microtubuli en chromosoomuitlijning tijdens celdeling 17,18,19. Antilichaammicro-injectie 20,21, siRNA-depletie22,23, chemische remming 24,25,26 en genetische deletie 27,28,29 van CENP-E leidt tot chromosoomafwijking, de activering van het controlepunt van de spoelassemblage en mitotische defecten, wat resulteert in aneuploïdie en chromosomale instabiliteit 19,30. Bij muizen resulteert CENP-E-deletie in abnormale ontwikkeling en embryonale letaliteit in de zeer vroege stadia van ontwikkeling 27,29,31. Genetische deletie van CENP-E leidt meestal tot een verkeerde uitlijning van chromosomen en celdood 26,27,29, wat een obstakel vormt bij het bestuderen van de functies en mechanismen van de CENP-E-eiwitten.
Een recente studie heeft een voorwaardelijke CENP-E knock-out cellijn vastgesteld met behulp van een Auxine-induceerbare CRISPR/Cas9-genbewerkingsmethode32, die een snelle afbraak van CENP-E-eiwitten in relatief korte tijd mogelijk maakt33. Tot op heden zijn er echter geen stabiele CENP-E knock-out cellijnen tot stand gebracht, wat een onopgeloste technische uitdaging is in de CENP-E-biologie. Gezien genetische robuustheid34, genetische compensatieresponsen 35,36,37 en complexe intracellulaire omgevingen, aangezien de directe gevolgen van volledige deletie van CENP-E complex en onvoorspelbaar kunnen zijn, is het belangrijk om CENP-E knock-outcellijnen vast te stellen voor het onderzoek naar mechanismen van chromosoomuitlijning, controlepunt van de spindelassemblage en stroomafwaartse signaalroutes.
De ontdekking en toepassingen van CENP-E-remmers zijn belangrijk voor de behandeling van kanker. Tot op heden zijn zeven soorten CENP-E-remmers gevonden en gesynthetiseerd, waaronder GSK923295 en zijn derivaten24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pyridinesteigerderivaten40,41, verbinding-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 en benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazoolderivaten47. Onder deze remmers is GSK923295 een allosterische en efficiënte CENP-E-remmer die zich bindt aan het motorische domein van CENP-E en CENP-E microtubuli-gestimuleerde ATPase-activiteit remt met een Ki van 3,2 ± 0,2 nM24,25. Vergeleken met de remmende effecten van GSK923295 op gekweekte kankercellen, zijn de therapeutische effecten van GSK923295 bij klinische kankerpatiënten echter niet ideaal48,49, wat ook aanleiding gaf tot bezorgdheid over de specificiteit van GSK923295 voor CENP-E. Bovendien zijn de specificiteit en bijwerkingen van andere CENP-E-remmers op de CENP-E-eiwitten belangrijke kwesties in kankeronderzoek.
In deze studie hebben we het CENP-E-gen in HeLa-cellen volledig uitgeschakeld met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem. Er zijn drie geoptimaliseerde op fenotypen gebaseerde screeningstrategieën vastgesteld, waaronder screening van celkolonies, fenotypes van chromosoomuitlijning en de fluorescerende intensiteiten van CENP-E-eiwitten, om de screeningefficiëntie en het slagingspercentage van CENP-E-genbewerking te verbeteren. Bovendien kunnen CENP-E knock-out cellijnen worden gebruikt om de specificiteit van kandidaat-verbindingen voor CENP-E te testen.
Kinesine-7 CENP-E is een belangrijke regulator in de uitlijning van chromosomen en het controlepunt van de spoelassemblage tijdens celdeling 17,19,20. Genetische deletie van CENP-E resulteert meestal in de activering van het controlepunt van de spindelassemblage, het stoppen van de celcyclus en celdood 27,29,51,52.<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
We danken alle leden van het Cytoskeleton Laboratory van de Fujian Medical University voor nuttige discussies. We danken Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin en Min-Xia Wu van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor hun technische assistentie. We danken Si-Yi Zheng, Ying Lin en Qi Ke van het Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences aan de Fujian Medical University voor hun steun. Deze studie werd ondersteund door de volgende subsidies: National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 82001608 en 82101678), Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (subsidienummer 2019J05071), de Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, de provincie Fujian, China (subsidienummer 2021Y9160) en Fujian Medical University high-level talents scientific research start-up funding project (subsidienummer XRCZX2017025).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
24-well plate | Corning | 3524 | |
4S Gelred, 10,000x in water | Sangon Biotech (Shanghai) | A616697 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 10009164 | |
96-well plate | Corning | 3599 | |
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10000218 | Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution. |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) | A620014 | |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 100092690 | |
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab254326 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution |
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution. |
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab133583 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Slowing down the quenching of fluorescent signals. |
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody | Abcam | ab7291 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sinopharm Chemical Reagent | 69003435 | |
BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay | Promega | G3580 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Colchicine | Sinopharm Chemical Reagent | 61001563 | |
Confocal scanning microscope | Leica | Leica TCS SP8 | |
Coverslip | CITOTEST | 80344-1220 | |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
DH5α competent cells | Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
DL2000 DNA marker | TaKaRa | 3427A | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Endo-free plasmid mini kit | Omega | D6950 | |
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
Gentian violet | Sinopharm Chemical Reagent | 71019944 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS. |
Giemsa staining solution | Sinopharm Chemical Reagent | 71020260 | |
GraphPad Prism version 8.0 software | GraphPad | www.graphpad.com | Statistical analysis. |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
Humidified incubator | Heal Force | HF90/HF240 | |
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Image processing and analysis. |
Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
LB agar powder | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
Lipo6000 transfection reagent | Beyotime | C0526 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS. |
Penicillin-streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
SanPrep column DNA gel extraction kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
SanPrep column plasmid mini-preps kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | |
T4 polynucleotide kinase | TaKaRa | 2021A | |
TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent | 30189328 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS. |