JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

יצירת Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

מאמר זה מדווח על בניית תאי נוקאאוט הקשורים לצנטרומר לחלבון-E (CENP-E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 ושלוש אסטרטגיות סינון מבוססות פנוטיפ. השתמשנו בקו תאי הנוקאאוט של CENP-E כדי לבסס גישה חדשנית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E, שהיא שימושית לפיתוח תרופות ולמחקר ביולוגי.

Abstract

מערכת CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9 התפתחה ככלי רב עוצמה לעריכת גנים מדויקת ויעילה במגוון אורגניזמים. Centromere-associated protein-E (CENP-E) הוא קינזין מכוון פלוס הנדרש ללכידת קינטוחור-מיקרוטובול, יישור כרומוזומים ומחסום הרכבת ציר. למרות שתפקודים תאיים של חלבוני CENP-E נחקרו היטב, היה קשה לחקור את הפונקציות הישירות של חלבוני CENP-E באמצעות פרוטוקולים מסורתיים מכיוון שאבלציה של CENP-E מובילה בדרך כלל להפעלת מחסום הרכבת צירים, מעצר מחזור תאים ומוות תאי. במחקר זה, חיסלנו לחלוטין את הגן CENP-E בתאי HeLa אנושיים ויצרנו בהצלחה את תאי CENP-E-/- HeLa באמצעות מערכת CRISPR/Cas9.

נקבעו שלוש אסטרטגיות סינון אופטימליות המבוססות על פנוטיפים, כולל סינון מושבות תאים, פנוטיפים של יישור כרומוזומים ועוצמות פלואורסצנטיות של חלבוני CENP-E, המשפרים ביעילות את יעילות הסינון ואת שיעור ההצלחה הניסויית של תאי הנוקאאוט CENP-E . חשוב לציין, מחיקת CENP-E גורמת לחוסר תיאום כרומוזומים, למיקום לא תקין של חלבוני המחסום המיטוטי BUB1 serine/threonine kinase B (BubR1) ולפגמים מיטוטיים. יתר על כן, השתמשנו במודל תאי HeLa הנוקאאוט של CENP-E כדי לפתח שיטת זיהוי עבור מעכבי CENP-E ספציפיים.

במחקר זה נקבעה גישה שימושית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E. יתר על כן, מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של עריכת גנים CENP-E באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, אשר יכול להיות כלי רב עוצמה לחקור את המנגנונים של CENP-E בחלוקת התא. יתר על כן, קו תאי הנוקאאוט של CENP-E יתרום לגילוי ותיקוף של מעכבי CENP-E, שיש להם השלכות חשובות על פיתוח תרופות נגד גידולים, מחקרים על מנגנוני חלוקת תאים בביולוגיה של התא ויישומים קליניים.

Introduction

עריכת גנום מהונדסת מתווכת את השינויים הממוקדים של גנים במגוון תאים ואורגניזמים. באיקריוטים, מוטגנזה ספציפית לאתר יכולה להיות מוצגת על ידי יישומים של נוקלאזות ספציפיות לרצף המעוררות רקומבינציה הומולוגית של דנ”א מטרה1. בשנים האחרונות, מספר טכנולוגיות לעריכת גנום, כולל נוקלאזות אצבע אבץ (ZFNs)2,3, נוקלאזות אפקט דמוי מפעיל שעתוק (TALENs)4,5, ומגנוקלאזות ביות 6,7, הונדסו כדי לבקע גנומים באתרים ספציפיים, אך גישות אלה דורשות הנדסת חלבונים מורכבת והליכי ניסוי מיותרים. מחקרים הראו כי מערכת CRISPR/Cas (ראשי תיבות של Type II prokaryotic clustered regular interspaced short palindromic repeats) היא טכנולוגיה יעילה לעריכת גנים, המתווכת באופן ספציפי מחשוף DNA מונחה RNA וספציפי לאתר במגוון רחב של תאים ומינים 8,9,10,11. טכנולוגיית נוקאאוט הגנים CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה בתחומי הביולוגיה הבסיסית, הביוטכנולוגיה והרפואה12.

חיידקים ורוב הארכאונים פיתחו מערכת חיסון נרכשת מבוססת רנ”א המשתמשת בחלבוני CRISPR ו-Cas כדי לזהות ולהשמיד נגיפים ופלסמידים13. סטרפטוקוקוס פיוגנס Cas9 (SpCas9) endonuclease מכיל את התחום RuvC-like Holliday junction resolvase (RuvC) ואת התחום His-Asn-His (HNH), אשר יכול לתווך ביעילות הפסקות דו-גדיליות ספציפיות לרצף (DSB) על ידי אספקת RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA) המכיל RNA קריספר (crRNA) ו-crRNA מפעיל טרנס (tracrRNA)14,15,16. ניתן לתקן DSB באמצעות מסלול חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), אשר מציג מוטציות מרובות, כולל החדרות, מחיקות או תחליפי נוקלאוטידים בודדים ללא צלקת, בתאי יונקים 1,8. ניתן להשתמש הן במסלול NHEJ הנוטה לשגיאות והן במסלול HDR בנאמנות גבוהה כדי לתווך נוקאאוט גנים באמצעות החדרות או מחיקות, מה שעלול לגרום למוטציות frameshift וקודוני עצירה מוקדמים10.

Kinesin-7 CENP-E נדרש עבור חיבור kinetochore-microtubule ויישור כרומוזומים במהלך חלוקת התא 17,18,19. מיקרו-הזרקת נוגדנים20,21, דלדול siRNA22,23, עיכוב כימי 24,25,26 ומחיקה גנטית 27,28,29 של CENP-E מובילה לחוסר תיאום כרומוזומים, הפעלת מחסום הרכבת ציר ופגמים מיטוטיים, מה שגורם לאנאופלואידיות ואי יציבות כרומוזומלית19,30. בעכברים, מחיקת CENP-E גורמת להתפתחות לא תקינה ולקטלניות עוברית בשלבים מוקדמים מאוד של ההתפתחות 27,29,31. מחיקה גנטית של CENP-E מובילה בדרך כלל לחוסר תיאום כרומוזומים ולמוות תאי 26,27,29, המהווה מכשול בחקר הפונקציות והמנגנונים של חלבוני CENP-E.

מחקר שנערך לאחרונה ביסס קו תאי נוקאאוט מותנה של CENP-E באמצעות שיטת עריכת גנים CRISPR/Cas932 הניתנת להשראת אוקסין, המאפשרת פירוק מהיר של חלבוני CENP-E בזמן קצר יחסית33. עם זאת, עד כה, קווי תאי נוקאאוט יציבים של CENP-E לא נקבעו, וזהו אתגר טכני בלתי פתור בביולוגיה של CENP-E. בהתחשב בחוסן גנטי34, בתגובות פיצוי גנטי 35,36,37 ובסביבות תוך-תאיות מורכבות, מכיוון שההשלכות הישירות של מחיקה מוחלטת של CENP-E עשויות להיות מורכבות ובלתי צפויות, חשוב לבסס קווי תאי נוקאאוט של CENP-E לחקר מנגנונים של יישור כרומוזומים, מחסום הרכבת ציר ומסלולי איתות במורד הזרם.

הגילוי והיישומים של מעכבי CENP-E חשובים לטיפול בסרטן. עד כה, שבעה סוגים של מעכבי CENP-E נמצאו וסונתזו, כולל GSK923295 ונגזרותיו24,25, PF-277138,39, אימידזו[1,2-a]נגזרות פיגום פירידין40,41, תרכובת A42,43, סינטלין44,45, UA6278446, ובנזו[ד]פירולו[2,1-b]נגזרות תיאזול47. בין מעכבים אלה, GSK923295 הוא מעכב CENP-E אלוסטרי ויעיל הנקשר לתחום המוטורי של CENP-E ומעכב פעילות ATPase מגורה מיקרוטובול CENP-E עם Ki של 3.2 ± 0.2 ננומטר24,25. עם זאת, בהשוואה להשפעות המעכבות של GSK923295 על תאי סרטן בתרבית, ההשפעות הטיפוליות של GSK923295 בחולי סרטן קליני אינן אידיאליות48,49, מה שהעלה גם חששות לגבי הספציפיות של GSK923295 עבור CENP-E. יתר על כן, הספציפיות ותופעות הלוואי של מעכבי CENP-E אחרים על חלבוני CENP-E הם נושאים מרכזיים בחקר הסרטן.

במחקר זה, חיסלנו לחלוטין את הגן CENP-E בתאי HeLa באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. נקבעו שלוש אסטרטגיות סינון אופטימליות מבוססות פנוטיפ, כולל סינון מושבות תאים, פנוטיפים של יישור כרומוזומים ועוצמות פלואורסצנטיות של חלבוני CENP-E, כדי לשפר את יעילות הסינון ואת שיעור ההצלחה של עריכת גנים CENP-E. יתר על כן, ניתן להשתמש בקווי תאי נוקאאוט של CENP-E כדי לבדוק את הספציפיות של תרכובות מועמדות עבור CENP-E.

Protocol

1. בניית וקטורי הנוקאאוט של הגן CRISPR/Cas9 בחר את רצף ה- DNA הגנומי של היעד על הגן האנושי CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) ולעצב את ה-sgRNA באמצעות כלי מקוון לעיצוב CRISPR (http://crispor.tefor.net/). הזן רצף גנומי יחיד, בחר את הגנום של “הומו ספיינס-אדם-UCSC דצמבר 2013 (ערכת ניתוח hg38) + פולימורפיזמים ?…

Representative Results

תאי CENP-E-/- HeLa נוצרו בהצלחה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 (איור 1). ציר הזמן ושלבי הניסוי הקריטיים של שיטה זו מוצגים באיור 1. ראשית, תכננו וסינתזנו את ה-sgRNA הספציפי ל-CENP-E, חישלנו וקשרנו את ה-sgRNA לפלסמיד pX458, הדבקנו את הפלסמיד לתאי HeLa ותרבנו אותם במשך 48 שעות. ה?…

Discussion

Kinesin-7 CENP-E הוא וסת מפתח ביישור כרומוזומים ומחסום הרכבת ציר במהלך חלוקת התא 17,19,20. מחיקה גנטית של CENP-E גורמת בדרך כלל להפעלת מחסום הרכבת ציר, מעצר מחזור תאים ומוות תאי 27,29,51,52</s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי מעבדת Cytoskeleton באוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על דיונים מועילים. אנו מודים לג’ון-ג’ין לין, ג’י-הונג הואנג, לינג לין, לי-לי פאנג, לין-יינג ג’ואו, שי לין ומין-שיה וו במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על עזרתם הטכנית. אנו מודים לסי-יי ג’נג, יינג לין וצ’י קה במרכז ההוראה הניסויית למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על תמיכתם. מחקר זה נתמך על ידי המענקים הבאים: הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מספר 82001608 ו -82101678), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג’יאן, סין (מענק מספר 2019J05071), הקרנות המשותפות לחדשנות של מדע וטכנולוגיה, מחוז פוג’יאן, סין (מענק מספר 2021Y9160), ופרויקט מימון סטארט-אפ למחקר מדעי ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג’יאן (מענק מספר XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Ricerca sul cancro. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell’s functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

Keywords: CENP-ECRISPR/Cas9KnockoutHeLa CellsChromosome AlignmentMitotic DefectsCell Cycle ArrestCell DeathKinetochore-microtubule CaptureSpindle Assembly Checkpoint
check_url/it/65476?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image