JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65476
, , , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, 4Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Bu makale, CRISPR/Cas9 sistemi ve üç fenotip tabanlı tarama stratejisi kullanılarak sentromerle ilişkili protein-E (CENP-E) nakavt hücrelerinin yapımını bildirmektedir. İlaç geliştirme ve biyolojik araştırmalar için yararlı olan CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yeni bir yaklaşım oluşturmak için CENP-E nakavt hücre hattını kullandık.

Abstract

CRISPR (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar) / Cas9 sistemi, çeşitli organizmalarda hassas ve verimli gen düzenleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Sentromer ile ilişkili protein-E (CENP-E), kinetokor-mikrotübül yakalama, kromozom hizalaması ve mil montaj kontrol noktası için gerekli olan artı uca yönelik bir kinesindir. CENP-E proteinlerinin hücresel fonksiyonları iyi çalışılmış olmasına rağmen, CENP-E proteinlerinin doğrudan fonksiyonlarını geleneksel protokoller kullanarak incelemek zor olmuştur çünkü CENP-E ablasyonu genellikle iğ montaj kontrol noktası aktivasyonuna, hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne yol açar. Bu çalışmada, insan HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık ve CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E-/- HeLa hücrelerini başarıyla ürettik.

Hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere, CENP-E nakavt hücrelerinin tarama verimliliğini ve deneysel başarı oranını etkili bir şekilde artıran üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Önemli olarak, CENP-E delesyonu, kromozomun yanlış hizalanmasına, BUB1 mitotik kontrol noktası serin / treonin kinaz B (BubR1) proteinlerinin anormal konumuna ve mitotik kusurlara neden olur. Ayrıca, CENP-E’ye özgü inhibitörler için bir tanımlama yöntemi geliştirmek için CENP-E nakavt HeLa hücre modelini kullandık.

Bu çalışmada, CENP-E inhibitörlerinin özgüllüğünü ve toksisitesini doğrulamak için yararlı bir yaklaşım oluşturulmuştur. Ayrıca, bu makale, hücre bölünmesinde CENP-E mekanizmalarını araştırmak için güçlü bir araç olabilecek CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak CENP-E gen düzenleme protokollerini sunmaktadır. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hattı, antitümör ilaç geliştirme, hücre biyolojisinde hücre bölünme mekanizmaları çalışmaları ve klinik uygulamalar için önemli etkileri olan CENP-E inhibitörlerinin keşfine ve doğrulanmasına katkıda bulunacaktır.

Introduction

Tasarlanmış genom düzenleme, çeşitli hücrelerde ve organizmalarda genlerin hedeflenen modifikasyonlarına aracılık eder. Ökaryotlarda, bölgeye özgü mutajenez, hedef DNA1’in homolog rekombinasyonunu uyaran diziye özgü nükleazların uygulanmasıyla tanıtılabilir. Son yıllarda, çinko parmak nükleazları (ZFN’ler)2,3, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN’ler)4,5 ve güdümlü meganükleazlar 6,7 dahil olmak üzere çeşitli genom düzenleme teknolojileri, genomları belirli bölgelerde parçalamak için tasarlanmıştır, ancak bu yaklaşımlar karmaşık protein mühendisliği ve gereksiz deneysel prosedürler gerektirir. Çalışmalar, tip II prokaryotik kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/Cas sisteminin, çok çeşitli hücrelerde ve türlerdeRNA kılavuzlu, bölgeye özgü DNA bölünmesine spesifik olarak aracılık eden verimli bir gen düzenleme teknolojisi olduğunu göstermiştir 8,9,10,11. CRISPR/Cas9 gen nakavt teknolojisi, temel biyoloji, biyoteknoloji ve tıp alanlarında devrim yarattı12.

Bakteriler ve çoğu arke, virüsleri ve plazmitleri tanımlamak ve yok etmek için CRISPR ve Cas proteinlerini kullanan RNA tabanlı bir adaptif bağışıklık sistemi geliştirmiştir13. Streptokok pyogenes Cas9 (SpCas9) endonükleaz, CRISPR RNA’ları (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) içeren sentetik bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sağlayarak diziye özgü, çift sarmallı kırılmalara (DSB’ler) verimli bir şekilde aracılık edebilen RuvC benzeri Holliday bağlantı resolvazı (RuvC) ve His-Asn-His (HNH) alanını içerir14,15,16. DSB’ler, memeli hücrelerinde insersiyonlar, delesyonlar veya yara izi olmayan tek nükleotid ikameleri dahil olmak üzere çoklu mutasyonları ortaya çıkaran indel oluşturan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu ile onarılabilir 1,8. Hem hataya eğilimli NHEJ hem de yüksek kaliteli HDR yolu, çerçeve kayması mutasyonlarına ve erken durdurma kodonlarına neden olabilen eklemeler veya silmeler yoluyla gen nakavtına aracılık etmek için kullanılabilir10.

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi sırasında kinetokor-mikrotübül bağlanması ve kromozom hizalaması için gereklidir 17,18,19. CENP-E’nin antikor mikroenjeksiyonu20,21, siRNA tükenmesi22,23, kimyasal inhibisyon 24,25,26 ve genetik delesyon 27,28,29, kromozom yanlış hizalanmasına, iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonuna ve mitotik defektlere yol açar, bu da anöploidi ve kromozomal instabilite ile sonuçlanır19,30. Farelerde, CENP-E delesyonu, gelişimin çok erken aşamalarında anormal gelişim ve embriyonik ölümcüllük ile sonuçlanır 27,29,31. CENP-E’nin genetik silinmesi genellikle kromozomun yanlış hizalanmasına ve hücre ölümüne yol açar 26,27,29, bu da CENP-E proteinlerinin işlevlerini ve mekanizmalarını incelemede bir engeldir.

Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CENP-E proteinlerinin nispeten kısa sürede hızlı bir şekilde parçalanmasını sağlayan bir Auxin ile indüklenebilir CRISPR / Cas9 gen düzenleme yöntemi32 kullanarak koşullu bir CENP-E nakavt hücre hattı oluşturmuştur33. Bununla birlikte, bugüne kadar, CENP-E biyolojisinde çözülmemiş bir teknik zorluk olan kararlı CENP-E nakavt hücre hatları kurulmamıştır. CENP-E’nin tamamen silinmesinin doğrudan sonuçları karmaşık ve öngörülemez olabileceğinden, genetik sağlamlık34, genetik kompanzasyon yanıtları 35,36,37 ve karmaşık hücre içi ortamlar göz önüne alındığında, kromozom hizalama mekanizmalarının araştırılması için CENP-E nakavt hücre hatlarının oluşturulması önemlidir.

CENP-E inhibitörlerinin keşfi ve uygulamaları kanser tedavisi için önemlidir. Bugüne kadar, GSK923295 ve türevleri24,25, PF-277138,39, imidazo [1,2-a] piridin iskele türevleri40,41, bileşik-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 ve benzo [d] pirolo [2,1-b] tiazol türevleri47 dahil olmak üzere yedi tip CENP-E inhibitörü bulunmuş ve sentezlenmiştir. Bu inhibitörler arasında GSK923295, CENP-E’nin motor alanına bağlanan ve CENP-E mikrotübül ile uyarılan ATPaz aktivitesini 3.2 ila 0.2 nM24,25’lik bir Ki ile inhibe eden allosterik ± etkili bir CENP-E inhibitörüdür. Bununla birlikte, GSK923295’nin kültürlenmiş kanser hücreleri üzerindeki inhibitör etkileri ile karşılaştırıldığında, klinik kanser hastalarında GSK923295 terapötik etkileri ideal değildir48,49, bu da CENP-E için GSK923295 özgüllüğü konusunda endişeleri artırmıştır. Ayrıca, diğer CENP-E inhibitörlerinin CENP-E proteinleri üzerindeki özgüllüğü ve yan etkileri, kanser araştırmalarında kilit konulardır.

Bu çalışmada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak HeLa hücrelerindeki CENP-E genini tamamen devre dışı bıraktık. CENP-E gen düzenlemesinin tarama verimliliğini ve başarı oranını artırmak için hücre kolonisi taraması, kromozom hizalama fenotipleri ve CENP-E proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere optimize edilmiş üç fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur. Ayrıca, CENP-E nakavt hücre hatları, CENP-E için aday bileşiklerin özgüllüğünü test etmek için kullanılabilir.

Protocol

1. CRISPR/Cas9 gen nakavt vektörlerinin oluşturulması İnsan CENP-E genindeki hedef genomik DNA dizisini seçin (GenBank Erişim No. NM_001286734.2) ve çevrimiçi bir CRISPR tasarım aracı (http://crispor.tefor.net/) kullanarak sgRNA’yı tasarlayın. Tek bir genomik dizi girin, “Homo sapiens-insan-UCSC Aralık 2013 (hg38 analiz seti) + tek nükleotid polimorfizmleri (SNP’ler): dbSNP148” genomunu seçin ve “20 bp-NGG-spCas9” protospacer bitişik motifini seçin. …

Representative Results

CENP-E-/- HeLa hücreleri, CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak başarıyla üretildi (Şekil 1). Bu yöntemin zaman çizelgesi ve kritik deneysel adımları Şekil 1’de gösterilmektedir. İlk olarak, CENP-E’ye özgü sgRNA’ları tasarladık ve sentezledik, sgRNA’ları tavladık ve pX458 plazmidine bağladık, plazmiti HeLa hücrelerine transfekte ettik ve 48 saat boyunca kültürledik. Transfekte edilen hücreler ayrıştırıldı ve …

Discussion

Kinesin-7 CENP-E, hücre bölünmesi 17,19,20 sırasında kromozom hizalamasında ve iğ montaj kontrol noktasında önemli bir düzenleyicidir. CENP-E’nin genetik silinmesi genellikle iğ montaj kontrol noktasının aktivasyonu, hücre döngüsü durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır 27,29,51,52.</su…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Fujian Tıp Üniversitesi’ndeki Hücre İskeleti Laboratuvarı’nın tüm üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi’nden Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin ve Min-Xia Wu’ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. Fujian Tıp Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Deneysel Öğretim Merkezi’nden Si-Yi Zheng, Ying Lin ve Qi Ke’ye destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 82001608 ve 82101678), Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (hibe numarası 2019J05071), Bilim ve Teknoloji İnovasyonu için Ortak Fonlar, Fujian Eyaleti, Çin (hibe numarası 2021Y9160) ve Fujian Tıp Üniversitesi üst düzey yetenekler bilimsel araştırma başlangıç fonu projesi (hibe numarası XRCZX2017025).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764 (2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056 (2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Ricerca sul cancro. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358 (2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell’s functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675 (2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010 (2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381 (2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481 (2020).

Tags

Keywords: CENP-ECRISPR/Cas9KnockoutHeLa CellsChromosome AlignmentMitotic DefectsCell Cycle ArrestCell DeathKinetochore-microtubule CaptureSpindle Assembly Checkpoint
check_url/it/65476?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image