Approche unique pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse du rat avec une capacité comparable
Summary
Cette recherche décrit deux techniques pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles abondants (TNE) de la moelle osseuse du rat. Une méthode combine un kit d’isolement des neutrophiles commercial avec une centrifugation à gradient de densité, tandis que l’autre utilise uniquement la centrifugation à gradient de densité. Les deux approches produisent des TNE fonctionnelles surpassant celles des neutrophiles du sang périphérique.
Abstract
L’objectif principal de cette recherche était de développer une approche fiable et efficace pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) de la moelle osseuse du rat. Cet effort est dû aux limites associées à la méthode traditionnelle d’extraction des TNE du sang périphérique, principalement en raison de la rareté des neutrophiles disponibles pour l’isolement. L’étude a révélé deux méthodologies distinctes pour obtenir des neutrophiles de rat à partir de la moelle osseuse : une procédure simplifiée en une étape qui a donné des niveaux de purification satisfaisants, et un processus en deux étapes plus long qui a montré une efficacité de purification améliorée. Il est important de noter que les deux techniques ont produit une quantité substantielle de neutrophiles viables, allant de 50 à 100 millions par rat. Cette efficacité reflétait les résultats obtenus en isolant les neutrophiles de sources humaines et murines. De manière significative, les neutrophiles dérivés de la moelle osseuse du rat présentaient des capacités comparables à sécréter des TNE par rapport aux neutrophiles obtenus à partir du sang périphérique. Cependant, la méthode basée sur la moelle osseuse a systématiquement produit des quantités nettement plus importantes de neutrophiles et de TNE. Cette approche a démontré le potentiel d’obtenir des quantités significativement plus importantes de ces composants cellulaires pour d’autres applications en aval. Notamment, ces TNE et neutrophiles isolés sont prometteurs pour une gamme d’applications, couvrant les domaines de l’inflammation, des infections et des maladies auto-immunes.
Introduction
Les neutrophiles constituent un sous-ensemble essentiel de leucocytes qui jouent un rôle central dans la réponse immunitaire innée. Ils sont caractérisés par des noyaux et des granules multilobés contenant diverses protéases et peptides antimicrobiens1. Les neutrophiles fonctionnent principalement par dégranulation, phagocytose et formation de TNE. L’observation des TNE a été faite pour la première fois par Takei et al. en 1996 lors d’une expérience où les neutrophiles ont été stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA)2. Par la suite, le processus de formation des TNE a été baptisé « NETose » par Brinkmann et al.3 en 2004. Leurs recherches ont mis en lumière le rôle crucial des TNE dans les réponses antimicrobiennes médiées par les neutrophiles. Les TNE sont des structures en forme de toile composées de chromatine, d’histones et de protéines antimicrobiennes qui sont libérées par les neutrophiles activés en réponse à des stimuli infectieux et inflammatoires. Les TNE peuvent immobiliser et tuer les agents pathogènes envahissants en les piégeant et en les exposant à une forte concentration de peptides et de protéases antimicrobiens 1,3. De plus, les TNE contribuent à l’élimination des cellules apoptotiques et participent à la résolution de l’inflammation. Des études récentes indiquent également qu’une formation excessive de TNEs ou une dégradation altérée des TNE peut entraîner des lésions tissulaires, des troubles auto-immuns, une thrombogenèse et une altération de la revascularisation 4,5,6,7,8,9,10.
Le rôle pathogène des TNE dans la fibrose non contrôlée après un infarctus du myocarde et la formation d’anévrismes ventriculaires a été démontré par l’expansion de la fibrose périvasculaire 4,11. Le modèle d’infarctus du myocarde et l’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse chez la souris sont tous deux bien établis. Les leucocytes polymorphonucléaires (PMN), un type de globule blanc abondant dans le sang humain, constituent une excellente source pour isoler les neutrophiles humains. Cette méthode élimine le besoin de prélever de la moelle osseuse, améliorant ainsi la sécurité et l’efficacité.
Les TNE jouent également un rôle dans la fibrillation auriculaire associée au remodelage cardiaque. Cependant, de gros animaux tels que des chiens et des porcs ont été utilisés pour modéliser la fibrillation auriculaire, car les souris n’ont pas d’oreillette suffisamment grande pour établir un cycle de ré-entrée ou le modèle AF, à moins que des canaux ioniques ou des voies de signalisation spécifiques ne soient renversés ou éliminés12. Bien qu’il soit possible d’induire la fibrillation auriculaire chez le rat et d’isoler les neutrophiles du sang périphérique du rat comme décrit précédemment, les chercheurs ont rencontré une limite selon laquelle seuls 2 x 105-5 x 105 neutrophiles pouvaient être isolés du sang périphérique (10 ml par rat). L’extraction d’un nombre suffisant de TNE à chaque point nécessitait environ 10 à 25 rats (5 x 106 neutrophiles au total), ce qui entraînait un processus long, coûteux et souvent à faible rendement13. À cet égard, Li He et ses collègues présentent une stratégie axée sur la moelle osseuse pour obtenir des TNE adéquates à partir de rats14. Dans leur article, ils fournissent une description complète de l’isolement des neutrophiles de la moelle osseuse du rat et comparent les capacités de sécrétion de TNE des neutrophiles périphériques et de la moelle osseuse du rat. Les deux méthodes décrites répondent à des objectifs expérimentaux distincts, les deux aboutissant à des quantités suffisantes de neutrophiles de moelle osseuse de rat tout en réduisant le nombre de rats nécessaires. La méthode d’isolement en deux étapes a démontré une purification supérieure des neutrophiles, tandis que la méthode en une étape s’est avérée efficace en termes de temps avec des niveaux de purification acceptables. De plus, les chercheurs ont comparé la NETosis et la formation de TNE entre les neutrophiles de la moelle osseuse du rat et leurs homologues périphériques, trouvant une puissance égale à celle de la PMN. Ces résultats contribuent de manière significative aux études de la fibrillation auriculaire liées aux neutrophiles et soulignent l’importance de sélectionner de manière flexible différentes sources d’isolement des neutrophiles chez divers animaux de laboratoire avec des distributions de neutrophiles différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’isolement des neutrophiles constitue une étape cruciale dans l’étude de la NETosis, où le choix d’une méthode d’isolement appropriée est primordial pour obtenir des résultats fiables. Un facteur important à prendre en compte est la survenue d’une contamination lymphocytaire pendant l’isolement. Il est particulièrement important de relever ce défi lorsqu’il s’agit d’isoler les neutrophiles de rat de la moelle osseuse. Malgré la gamme de densité distincte des neutrophiles (1,0814-1,0919, avec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financement : Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (nos 82004154, 81900311, 82100336 et 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
Riferimenti
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
