Approccio unico per l'isolamento di neutrofili del midollo osseo di ratto con capacità comparabili
Summary
Questa ricerca delinea due tecniche per isolare abbondanti trappole extracellulari neutrofile (NET) dal midollo osseo di ratto. Un metodo combina un kit commerciale di isolamento dei neutrofili con la centrifugazione a gradiente di densità, mentre l’altro impiega solo la centrifugazione a gradiente di densità. Entrambi gli approcci producono NET funzionali che superano quelli dei neutrofili del sangue periferico.
Abstract
L’obiettivo principale di questa ricerca è stato quello di sviluppare un approccio affidabile ed efficiente per isolare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) dal midollo osseo di ratto. Questo sforzo è sorto a causa delle limitazioni associate al metodo tradizionale di estrazione dei NET dal sangue periferico, principalmente a causa della scarsità di neutrofili disponibili per l’isolamento. Lo studio ha rivelato due metodologie distinte per ottenere neutrofili di ratto dal midollo osseo: una procedura semplificata in una sola fase che ha prodotto livelli di purificazione soddisfacenti e un processo in due fasi più dispendioso in termini di tempo che ha mostrato una maggiore efficienza di purificazione. È importante sottolineare che entrambe le tecniche hanno prodotto una notevole quantità di neutrofili vitali, compresa tra 50 e 100 milioni per ratto. Questa efficienza rispecchia i risultati ottenuti isolando neutrofili da fonti sia umane che murine. Significativamente, i neutrofili derivati dal midollo osseo di ratto hanno mostrato capacità comparabili di secernere NET rispetto ai neutrofili ottenuti dal sangue periferico. Tuttavia, il metodo basato sul midollo osseo ha costantemente prodotto quantità notevolmente maggiori sia di neutrofili che di NET. Questo approccio ha dimostrato il potenziale per ottenere quantità significativamente maggiori di questi componenti cellulari per ulteriori applicazioni a valle. In particolare, questi NET isolati e neutrofili sono promettenti per una vasta gamma di applicazioni, che abbracciano i regni dell’infiammazione, dell’infezione e delle malattie autoimmuni.
Introduction
I neutrofili costituiscono un sottogruppo critico di leucociti che svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata. Sono caratterizzati da nuclei e granuli multilobati contenenti varie proteasi e peptidi antimicrobici1. I neutrofili funzionano principalmente attraverso la degranulazione, la fagocitosi e la formazione di NET. L’osservazione dei NET è stata fatta per la prima volta da Takei et al. nel 1996 durante un esperimento in cui i neutrofili sono stati stimolati con acetato di miristato di forbolo (PMA)2. Successivamente, il processo di formazione di NET è stato coniato “NETosis” da Brinkmann et al.3 nel 2004. La loro ricerca ha ulteriormente messo in luce il ruolo cruciale dei NET nelle risposte antimicrobiche mediate dai neutrofili. I NET sono strutture simili a ragnatele composte da cromatina, istoni e proteine antimicrobiche che vengono rilasciate dai neutrofili attivati in risposta a stimoli infettivi e infiammatori. I NET possono immobilizzare e uccidere gli agenti patogeni invasori intrappolandoli ed esponendoli a un’alta concentrazione di peptidi e proteasi antimicrobiche 1,3. Inoltre, i NET contribuiscono alla clearance delle cellule apoptotiche e partecipano alla risoluzione dell’infiammazione. Studi recenti indicano anche che un’eccessiva formazione di NET o una degradazione compromessa di NET possono portare a danni tissutali, malattie autoimmuni, trombogenesi e compromissione della rivascolarizzazione 4,5,6,7,8,9,10.
Il ruolo patogenetico dei NET nella fibrosi incontrollata a seguito di infarto miocardico e formazione di aneurismi ventricolari è stato dimostrato attraverso l’espansione della fibrosi perivascolare 4,11. Il modello dell’infarto del miocardio e l’isolamento dei neutrofili dal midollo osseo nei topi sono entrambi ben consolidati. I leucociti polimorfonucleati (PMN), un tipo di globuli bianchi abbondanti nel sangue umano, sono un’ottima fonte per isolare i neutrofili umani. Questo metodo elimina la necessità di prelevare il midollo osseo, migliorando così la sicurezza e l’efficienza.
I NET svolgono anche un ruolo nella fibrillazione atriale associata al rimodellamento cardiaco. Tuttavia, animali di grandi dimensioni come cani e maiali sono stati utilizzati per modellare la fibrillazione atriale, poiché i topi non hanno un atrio abbastanza grande da stabilire un ciclo di rientro o il modello AF, a meno che specifici canali ionici o vie di segnalazione non vengano abbattuti o eliminati12. Mentre è possibile indurre la fibrillazione atriale nei ratti e isolare i neutrofili dal sangue periferico del ratto come descritto in precedenza, i ricercatori hanno riscontrato una limitazione per cui solo 2 x 105-5 x 105 neutrofili potevano essere isolati dal sangue periferico (10 mL per ratto). L’estrazione di un numero sufficiente di NET in ogni punto temporale ha richiesto circa 10-25 ratti (5 x 106 neutrofili in totale), con il risultato di un processo dispendioso in termini di tempo, costoso e spesso a basso rendimento13. A questo proposito, Li He e colleghi presentano una strategia orientata al midollo osseo per ottenere NET adeguati dai ratti14. Nel loro articolo, forniscono una descrizione completa dell’isolamento dei neutrofili dal midollo osseo di ratto e confrontano le capacità di secrezione NET dei neutrofili periferici e del midollo osseo di ratto. I due metodi delineati si rivolgono a obiettivi sperimentali distinti, entrambi risultando in quantità sufficienti di neutrofili del midollo osseo di ratto e riducendo il numero di ratti necessari. Il metodo di isolamento in due fasi ha dimostrato una purificazione dei neutrofili superiore, mentre il metodo in una fase si è dimostrato efficiente in termini di tempo con livelli di purificazione accettabili. Inoltre, i ricercatori hanno confrontato la NETosis e la formazione di NET tra i neutrofili del midollo osseo di ratto e le loro controparti periferiche, trovando la stessa potenza con PMN. Questi risultati contribuiscono in modo significativo agli studi sulla fibrillazione atriale relativi ai neutrofili e sottolineano l’importanza di selezionare in modo flessibile diverse fonti per l’isolamento dei neutrofili in vari animali da esperimento con diverse distribuzioni di neutrofili.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’isolamento dei neutrofili costituisce un passo fondamentale nello studio di NETosis, dove la selezione di un metodo di isolamento appropriato è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Un fattore importante da valutare è l’insorgenza di contaminazione linfocitaria durante l’isolamento. Affrontare questa sfida è particolarmente significativo quando si isolano i neutrofili di ratto dal midollo osseo. Nonostante il distinto intervallo di densità dei neutrofili (1,0814-1,0919, con un picco a 1,0919) rispetto ai …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82004154, 81900311, 82100336 e 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
Riferimenti
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