Summary
Her præsenterer vi en protokol, der muliggør hurtig, robust og billig fremstilling af tumorsfæroider efterfulgt af hydrogelindkapsling. Det er bredt anvendeligt, da det ikke kræver specialudstyr. Det ville være særligt nyttigt til at udforske sfæroid-matrixinteraktioner og opbygge in vitro-vævsfysiologi eller patologimodeller.
Abstract
Tredimensionel (3D) indkapsling af sfæroider er afgørende for tilstrækkeligt at replikere tumormikromiljøet for optimal cellevækst. Her designede vi en in vitro 3D glioblastommodel til sfærisk indkapsling for at efterligne tumorens ekstracellulære mikromiljø. Først dannede vi firkantede pyramidale mikrobrøndforme ved hjælp af polydimethylsiloxan. Disse mikrobrøndforme blev derefter brugt til at fremstille tumorsfæroider med tæt kontrollerede størrelser fra 50-500 μm. Når sfæroider blev dannet, blev de høstet og indkapslet i polyethylenglycol (PEG) -baserede hydrogeler. PEG-hydrogeler er en alsidig platform til sfærisk indkapsling, da hydrogelegenskaber som stivhed, nedbrydelighed og celleklæbeevne kan indstilles uafhængigt. Her brugte vi en repræsentativ blød (~ 8 kPa) hydrogel til at indkapsle glioblastomspheroider. Endelig blev der udviklet en metode til at plette og billedsfæroider for at opnå billeder af høj kvalitet via konfokal mikroskopi. På grund af den tætte sfæroidkerne og relativt sparsomme periferi kan billeddannelse være vanskelig, men brug af en clearingopløsning og konfokal optisk sektionering hjælper med at lindre disse billeddannelsesvanskeligheder. Sammenfattende viser vi en metode til fremstilling af ensartede sfæroider, indkapsler dem i PEG-hydrogeler og udfører konfokalmikroskopi på de indkapslede sfæroider for at studere sfærisk vækst og forskellige cellematrixinteraktioner.
Introduction
Tumorsfæroider har vist sig som nyttige in vitro-værktøjer til at studere kræftætiologi, patologi og lægemiddelrespons1. Traditionelt er sfæroider blevet dyrket under forhold som lavvedhæftningsplader eller bioreaktorer, hvor celle-celle-adhæsion foretrækkes frem for celleoverfladevedhæftning2. Det er imidlertid nu anerkendt, at for at rekapitulere tumormikromiljøet mere trofast, bør in vitro sfæroidmodeller fange både celle-celle og celle-matrix interaktioner. Dette har fået flere grupper til at designe stilladser, såsom hydrogeler, hvor sfæroider kan indkapsles 3,4. Sådanne hydrogelbaserede sfæroidmodeller muliggør belysning af celle-celle- og cellematrixinteraktioner på forskellige celleadfærd, såsom levedygtighed, spredning, stamme eller terapirespons3.
Her beskriver vi en protokol til indkapsling af glioblastomsfæroider i polyethylenglycol (PEG) hydrogeler. Der er flere litteraturrapporter om glioblastomcelle sfærisk indkapsling i hydrogeler. For eksempel blev sfæroider dannet ved indkapsling af U87-celler i PEG-hydrogeler dekoreret med en RGDS-klæbende ligand og tværbundet med et enzymatisk spaltbart peptid for at bestemme effekten af hydrogelstivhed på celleadfærd5. U87-celler er også blevet dannet i andre PEG-baserede eller hyaluronsyrebaserede hydrogeler for at udvide kræftstamcellepopulationen6 eller for at udforske matrixmedierede mekanismer for kemoterapiresistens 7,8,9. Glioblastomsfæroider er også blevet indkapslet i gelatinehydrogeler for at studere krydstalen mellem mikroglia og kræftceller og dens virkning på celleinvasion10. Samlet set har sådanne undersøgelser vist nytten af hydrogelbaserede in vitro-modeller til forståelse af glioblastompatologi og udtænkning af behandlinger.
Endvidere er der forskellige metoder til tumorsfæroidfabrikation og hydrogelindkapsling11. For eksempel kunne dispergerede celler podes i hydrogeler og få lov til at danne sfæroider over tid 5,12. En ulempe ved en sådan metode er polydispersiteten af de dannede sfæroider, hvilket kan føre til differentielle celleresponser. For at producere ensartede sfæroider kunne celler indkapsles i mikrogeler og dyrkes i længere perioder, indtil de invaderer og ombygger gelen13, eller celler kunne deponeres i skabelongeler med sfæriske 'huller' og få lov til at aggregere14. Ulempen ved disse metoder er deres relative kompleksitet, behovet for en dråbegenerator eller andre midler til dannelse af mikrogeler eller 'hullerne' i gelen og den tid det tager for sfæroider at vokse og modnes. Alternativt kan sfæroider præformes i mikrobrønde 9,15,16 eller i hængende dråbeplader17,18 og derefter indkapsles i en hydrogel, svarende til den her beskrevne teknik. Disse metoder er enklere og kan udføres på en højere gennemstrømningsmåde. Interessant nok har det vist sig, at metoden til sfærisk dannelse kan påvirke sfærisk celleadfærd, såsom genekspression, celleproliferation eller lægemiddelrespons19,20.
Her fokuserer vi på glioblastom, da det er en solid tumor, hvis oprindelige miljø er den bløde, nanoporøse hjernematrix21, som kan efterlignes af en blød, nanoporøs hydrogel. Glioblastom er også den dødeligste hjernekræft, som der ikke er nogen tilgængelig kurmod 22. Imidlertid kan protokollen beskrevet her anvendes til indkapsling af sfæroider, der repræsenterer enhver fast tumor. Vi valgte at bruge PEG-hydrogeler, der dannes gennem en Michael-type additionsreaktion23. PEG er en syntetisk, ikke-nedbrydelig og biokompatibel hydrogel, der er inaktiv og fungerer som stilladser og fysisk cellestøtte, men understøtter ikke cellevedhæftning23. Celleklæbeevne kan tilsættes separat via tøjring af hele proteiner eller klæbende ligander24, og nedbrydelighed kan tilsættes via kemiske modifikationer af PEG-polymerkæden eller hydrolytisk eller enzymatisk nedbrydelige tværbindinger 25,26. Dette gør det muligt at indstille biokemiske egenskaber uafhængigt af mekaniske eller fysiske hydrogelegenskaber, hvilket kan være fordelagtigt ved undersøgelse af cellematrixinteraktioner. Michael-type geleringskemi er selektiv og sker under fysiologiske forhold; Derfor tillader det spheroid indkapsling ved blot at blande sfæroiderne med hydrogelforløberopløsningen.
Samlet set har den metode, der præsenteres her, flere bemærkelsesværdige egenskaber. For det første er fremstilling af tumorsfæroider i en multiwell-samling effektiv, hurtig, og omkostningerne ved de krævede materialer er lave. For det andet produceres sfæroiderne i store partier i forskellige størrelser med lav polydispersitet. Endelig kræves kun kommercielt tilgængelige materialer. Metodens anvendelighed illustreres ved at undersøge effekten af substrategenskaber på sfærisk cellelevedygtighed, cirkularitet og cellestamme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af opløsninger
- Fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) precursoropløsning
- Forbered den negative PDMS-forløberopløsning (bruges også til limforløberopløsningen). Hæld elastomeren i en vejebåd ved hjælp af en spatel og vej den. Tilsæt hærdningsmidlet til elastomerbasen i forholdet 1:10. Bland PDMS og hærdemiddel forsigtigt og grundigt med spatlen i plastvejebåden.
BEMÆRK: Denne PDMS-forløberopløsning hældes i den firkantede pyramideformede mikrobrøndplade med 6 brønde for at danne den negative form. Dette er den samme løsning, der bruges til limforløberopløsningen. - Forbered den positive PDMS-forløberopløsning. Hæld elastomerbasen ind i vejebåden ved hjælp af en spatel, og vej den. Tilsæt hærdningsmidlet til elastomerbasen i forholdet 1:9. Bland PDMS og hærdemiddel forsigtigt og grundigt med spatlen i plastvejebåden.
BEMÆRK: Denne PDMS-forløberopløsning hældes senere på den negative form for at danne den positive form.
- Forbered den negative PDMS-forløberopløsning (bruges også til limforløberopløsningen). Hæld elastomeren i en vejebåd ved hjælp af en spatel og vej den. Tilsæt hærdningsmidlet til elastomerbasen i forholdet 1:10. Bland PDMS og hærdemiddel forsigtigt og grundigt med spatlen i plastvejebåden.
- Fremstilling af 0,3 M triethanolamin (TEA) buffer af pH 8
- Der pipetteres 1 ml TEA og 9 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) til en 50 ml konisk ved hjælp af et pipettehjælpemiddel for at skabe en 0,75 M TEA opløsning. Opløsningen titreres til en pH-værdi på 8 ved hjælp af 1 N HCl eller 1 N NaOH. Derefter tilsættes nok 1x PBS til at opnå et slutvolumen på 25 ml for at opnå en endelig TEA-koncentration på 0,3 M med en pH-værdi på 8.
FORSIGTIG: Opbevar HCI- og NaOH-opløsninger i et brændbart skab ved stuetemperatur (RT). Brug personlige værnemidler ved håndtering.
- Der pipetteres 1 ml TEA og 9 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) til en 50 ml konisk ved hjælp af et pipettehjælpemiddel for at skabe en 0,75 M TEA opløsning. Opløsningen titreres til en pH-værdi på 8 ved hjælp af 1 N HCl eller 1 N NaOH. Derefter tilsættes nok 1x PBS til at opnå et slutvolumen på 25 ml for at opnå en endelig TEA-koncentration på 0,3 M med en pH-værdi på 8.
- Forberedelse af komplette medier
- For at forberede det komplette medie tilsættes 10% (w / v) eller 56 ml føtalt bovint serum og 1% (w / v) eller 5,6 ml penicillin og streptomycin til 500 ml RPMI-medium.
- Opløsningen anbringes ved 37 °C i 10-20 minutter, eller indtil opløsningen er varm før brug.
- Opbevar opløsningen ved 0-4 °C i op til 6 måneder.
- Fremstilling af 20 % (w/v) stamopløsninger af polyethylenglycol (PEG)
BEMÆRK: Beregningen er baseret på 100 μL løsninger, som kan skaleres op eller ned efter behov.- For at fremstille en 100 μL stamopløsning af 20 % w/v 4-armet PEG-acrylat (4-armet PEG-Ac) afvejes 20 mg 4-armet PEG-Ac-pulver i et mikrofugerør. Der tilsættes 70 μL 0,3 M TEA-buffer, hvorefter opløsningen hvirvles i ca. 30 s, eller indtil den er helt opløst. Der redegøres for volumenændring på grund af pulveropløsning ved at tilsætte tilstrækkelig TEA-buffer (~27 μL) til at nå et endeligt opløsningsvolumen på 100 μL.
- For at fremstille en 100 μL stamopløsning på 20% w/v PEG-diSH vejes 20 mg PEG-diSH-pulver i et mikrofugerør. Der tilsættes 70 μL TEA-buffer, hvorefter opløsningen hvirvles i ca. 30 s, eller indtil den er helt opløst. Der redegøres for volumenændring på grund af pulveropløsning ved at tilsætte tilstrækkelig TEA-buffer (~27 μL) til at nå et endeligt opløsningsvolumen på 100 μL.
BEMÆRK: PEG-pulveret er meget hygroskopisk og skal opbevares i en udtørret beholder ved -20 °C. Når du tager det ud af fryseren, skal du lade PEG-pulveret tø op i 10 minutter, før du åbner flasken for at veje pulveret. Rens flasken med en inaktiv gas såsom nitrogen eller argon for at fortrænge den fugtige luft, inden den returneres til fryseren. Stamopløsningen af 4-armet PEG-Ac kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger før brug. Stamopløsningen af PEG-diSH skal fremstilles umiddelbart før brug og kan ikke opbevares, fordi thiolgrupperne reagerer med hinanden og danner disulfidbindinger.
- Fremstilling af 2% v/v kældermembranmatrixopløsning
- For at forberede en 2% v/v arbejdsløsning til kældermembranmatrix tilsættes 20 μL af kældermembranmatrixen (LDEV-fri) til 9,98 ml komplet medie og blandes grundigt ved pipettering op og ned ~10 gange. Opløsningen fremstilles ved 4 °C (på is), opvarmes derefter til 37 °C (i ovn eller inkubator) og anvendes straks.
BEMÆRK: Kældermembranmatrixen begynder at danne en gel ved >10 °C, så sørg for at blande kældermembranmatrixopløsningen med komplette medier ved 2-6 °C. Den komplette mediesammensætning er beskrevet i trin 1.3.
- For at forberede en 2% v/v arbejdsløsning til kældermembranmatrix tilsættes 20 μL af kældermembranmatrixen (LDEV-fri) til 9,98 ml komplet medie og blandes grundigt ved pipettering op og ned ~10 gange. Opløsningen fremstilles ved 4 °C (på is), opvarmes derefter til 37 °C (i ovn eller inkubator) og anvendes straks.
- Fremstilling af cellefikseringsopløsningen
- For at fremstille 1 ml cellefikseringsopløsning indeholdende 4% w/v paraformaldehyd og 0,1% v/v nonionisk overfladeaktivt stof, blandes først 891 μL 1x PBS og 108 μL paraformaldehyd (37% w/v koncentration), og derefter tilsættes 1 μL nonionisk overfladeaktivt stof (100% koncentration). Bland opløsningen grundigt.
BEMÆRK: Fikseringsopløsning skal gøres frisk hver gang fiksering udføres.
FORSIGTIG: Paraformaldehyd er brandfarligt og kan danne brændbare støvkoncentrationer i luften. Det forårsager hudirritation og alvorlig øjenskade. Undgå at trække vejret ind, da det kan forårsage irritation af luftvejene. Håndter paraformaldehyd i en kemisk damphætte og brug personlige værnemidler. Vask hænderne grundigt efter håndtering. Det nonioniske overfladeaktive stof forårsager hudirritation og alvorlig øjenskade. Brug beskyttelseshandsker og øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse ved håndtering. For at undgå udslip i miljøet skal du åbne flasken i en kemisk damphætte. Vask hænderne grundigt efter håndtering.
- For at fremstille 1 ml cellefikseringsopløsning indeholdende 4% w/v paraformaldehyd og 0,1% v/v nonionisk overfladeaktivt stof, blandes først 891 μL 1x PBS og 108 μL paraformaldehyd (37% w/v koncentration), og derefter tilsættes 1 μL nonionisk overfladeaktivt stof (100% koncentration). Bland opløsningen grundigt.
- Fremstilling af farvningsopløsningerne
- For at forberede 3 mM 3,3'-dihexyloxacarbocyaniniodid (DiOC) blandes 2,65 mg DiOC i 1 ml DMSO.
- For at forberede 1,5 mM propidiumiodidopløsning (PI) blandes 1 mg PI i 1 ml deioniseret vand.
- Fremstilling af sfærisk clearingopløsning
- Forbered clearingopløsninger på 20%, 40% og 80% v/v formamid i 1x PBS til sfærisk clearing.
- For at fremstille 10 ml 20% v/v formamid blandes 8 ml 1x PBS efterfulgt af 2 ml formamid. For at fremstille 10 ml 40% v/v formamid blandes 6 ml 1x PBS efterfulgt af 4 ml formamid. For at fremstille 10 ml 80% v/v formamid blandes 2 ml 1x PBS efterfulgt af 8 ml formamid.
- Efter kombination af formamid og 1x PBS blandes opløsningen ved hvirvelstrøm i ca. 30 s.
- Forbered clearingopløsninger på 20%, 40% og 80% v/v formamid i 1x PBS til sfærisk clearing.
2. Fremstilling af firkantede pyramidale mikrobrønde
- Fabriker negativ PDMS-form af firkantede pyramideformede mikrobrønde som vist i figur 1.
- Forbered 2 g (~ 1 ml) negativ PDMS-forløberopløsning og hæld den på en brønd i en 6-brønds firkantet pyramideformet masterform. Bemærk, at 1 ml helt dækker en brønd på pladen. Efter at have dækket masterformen med PDMS, afgases PDMS-forløberopløsningen i 30 minutter ved at placere den firkantede pyramideplade med 6 brønde i en vakuumekssikkator. Hærd derefter PDMS ved at placere pladen i en 60 ° C ovn i 24 timer.
BEMÆRK: Sørg for, at pladelåget fjernes til afgasning og sættes på igen for hærdning. Afgas opløsningen i en vakuumekssikkator eller gennem rensning med en inaktiv gas, såsom nitrogen eller argon. Hvis den negative formforløberopløsning stadig har bobler efter 30 minutter, hvilket indikerer utilstrækkelig afgasning, skal du placere den i en vakuumekssikkator i yderligere 30 minutter. Brug en eller flere pladebrønde samtidigt til at forberede en eller flere PDMS-negative forme. Firkantede pyramidale mikrobrønde af forskellig størrelse kan anvendes, såsom 400 og 800 μm sidelængder, som vist i tabel 1. Den samme mængde PDMS anvendes uanset de firkantede pyramidestørrelser. - Når PDMS hærder, mens den stadig er varm, skal du forsigtigt fjerne den negative PDMS-form fra masterformen ved hjælp af en spatel og skære den negative form i en 35 mm i diameter plade ved hjælp af en biopsistans. Anbring i en petriskål og dæk med låget, og lad det fortsætte hærdningen RT i yderligere 24 timer.
BEMÆRK: For at fjerne negative forme skal du bruge en spatel til at komme mellem brøndpladen og PDMS-formen og forsigtigt trække den negative form fra masterformen. Formen skæres i 35 mm plader, så den passer til en 35 mm petriskål. Forme kan laves i andre størrelser for at passe plader med forskellige diametre. De 35 mm negative formplader kan opbevares, beskyttes mod støv ved RT og genbruges i 6 måneder.
- Forbered 2 g (~ 1 ml) negativ PDMS-forløberopløsning og hæld den på en brønd i en 6-brønds firkantet pyramideformet masterform. Bemærk, at 1 ml helt dækker en brønd på pladen. Efter at have dækket masterformen med PDMS, afgases PDMS-forløberopløsningen i 30 minutter ved at placere den firkantede pyramideplade med 6 brønde i en vakuumekssikkator. Hærd derefter PDMS ved at placere pladen i en 60 ° C ovn i 24 timer.
- Forbered positiv PDMS-form af firkantede pyramidale mikrobrønde.
- Anbring 35 mm pladerne af den negative PDMS-form i en 35 mm petriskål med de teksturerede mikrobrønde opad.
- Forbered 2,5 g (~ 1,2 ml) positiv PDMS-prækursoropløsning som ovenfor og hæld den på den negative form i 35 mm petriskålen for helt at dække den negative form. Derefter afgasses prækursoropløsningen i 30 minutter som ovenfor og anbringes i 60 °C ovn i 3-4 timer.
BEMÆRK: Fordi PDMS er tyktflydende, kan der dannes en boble fra luft fanget under den negative form. Hvis der dannes en boble under den negative form, skal du skubbe formen forsigtigt ned ved hjælp af en spatel for at frigøre boblen. Hvis der stadig er luftbobler tilbage, skal du fortsætte afgasningen i 30 minutter eller tage en spatel og forsigtigt røre den positive skimmelopløsning, indtil boblerne springer. - Når den positive PDMS-form hærder, skal du fjerne formene fra 35 mm petriskålen og straks skrælle den positive form fra den negative form.
BEMÆRK: Timing er vigtig for en vellykket skrælning af den positive form. Fjernelse gøres bedst ved let at skære i den positive form ved hjælp af en barbermaskine for at udsætte grænsefladen mellem den positive og negative form og skrælle formene fra hinanden. Skræl derefter kanterne af den cirkulære form væk. Skræl forsigtigt den negative form fra den positive form.
- Lim formene til bunden af brøndene på en 48-brøndplade.
BEMÆRK: Her bruges en 48-brønds plade, men andre plader kan bruges, så længe formpladerne skæres i de korrekte diametre (for eksempel 6 mm i diameter for en 96-brøndplade).- Skær de positive forme i plader ved hjælp af en 10 mm biopsistans.
BEMÆRK: Ca. 4 forme (hver 10 mm i diameter) kan skæres fra en positiv form med en diameter på 35 mm. - For at lime formene på bunden af en 48-brønds plade skal du forberede PDMS-limforløberopløsningen (~ 0,5 ml eller 1 g) som tidligere beskrevet27. Brug pincet til forsigtigt at dyppe den flade side (ikke siden med mønsteret af mikrobrønde) af den 10 mm positive form i PDMS-forløberopløsningen. Anbring forsigtigt en form pr. brønd på en 48-brønds plade, og tryk forsigtigt hver form til brøndbunden ved hjælp af pincetten. Anbring den samlede plade i en 60 °C ovn i 4-24 timer for at lade PDMS-limen hærde.
BEMÆRK: Hvis PDMS-limforløberopløsning kommer på de positive skimmelmikrobrønde, kan den tørres af med blødt vævspapir, og trinnet kan gentages. Når du limer, skal du sørge for, at limen ikke dækker mikrobrøndene. - Steriliser forme ved at tilsætte 300 μL 70% ethanol i hver brønd i 48-brøndpladen ved hjælp af en 1000 μL pipette. Opsug 70% ethanol og anbring 48-brøndpladen afdækket i en vævskulturhætte under UV (302 nm) i 2 timer.
BEMÆRK: Forme kan bruges i 6 måneder og gensteriliseres efter behov.
- Skær de positive forme i plader ved hjælp af en 10 mm biopsistans.
3. Multicellulær tumorsfæroiddannelse, høst og indkapsling i hydrogeler
BEMÆRK: Protokollen skitseret i dette afsnit er for U87 human glioblastomcellelinje (se figur 1 og figur 2), men en lignende protokol kan bruges med andre kræftcelletyper.
- Multicellulær tumor sfærisk dannelse
- Vask mikrobrøndforme først med en anti-vedhæftningsskylleopløsning ved at tilsætte 300 μL af opløsningen til hvert hul ved hjælp af en 1000 μL pipette. Derefter centrifugeres ved 1620 x g i 3 minutter og opsuges opløsningen ved hjælp af en vakuumpumpe og en Pasteur-pipette.
BEMÆRK: Udfør dette trin umiddelbart før cellesåning. - Udsæt cellerne for ~80 μL 0,25% trypsin/EDTA pr. cm2 af dyrkningskolbeområdet i 5 minutter ved 37 °C. For eksempel er 1 ml trypsin / EDTA passende til en T-25-cellekulturkolbe. Neutralisere trypsin ved at tilsætte det samme volumen af komplet cellekulturmedium. For eksempel tilsættes 1 ml komplet medium til den trypsinholdige T-25-cellekulturkolbe. Saml cellerne fra vævskulturkolben.
- Der overføres 10 μL af cellesuspensionen til hver port på et hæmocytometer til celletælling. Brug et omvendt mikroskop til at tælle det samlede antal celler og gennemsnittet af celletællingen fra mindst 8 kvadranter, hvilket sikrer, at cellenummeret i hver hæmocytometerkvadrant er 20-50 for gode celletællingsresultater. Multiplicer det beregnede tal med 104 for at bestemme den endelige cellekoncentration.
- Resuspender de opsamlede celler i det komplette RPMI-cellekulturmedium suppleret med 10 % føtalt bovint serum og 1 % penicillin/streptomycin ved en ønsket slutcellekoncentration, afhængigt af den ønskede sfæroidstørrelse, som vist i tabel 1.
BEMÆRK: 800 μm mikrobrønde giver ~ 75 sfæroider i en brønd i en 48-brøndplade, og 400 μm mikrobrønde giver ~ 300 sfæroider i en brønd i en 48-brøndplade. - 500 μL cellesuspension anbringes i den ønskede koncentration i mikrohuller, og pladen centrifugeres ved 1620 x g i 3 minutter. Pladen anbringes i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer for at tillade dannelse af sfæroider.
BEMÆRK: Hvis der ikke dannes sfæroider, kan 2% v / v af kældermembranmatrixen kombineret med komplette medier bruges til at resuspendere celler (flere detaljer i trin 1.5).
- Vask mikrobrøndforme først med en anti-vedhæftningsskylleopløsning ved at tilsætte 300 μL af opløsningen til hvert hul ved hjælp af en 1000 μL pipette. Derefter centrifugeres ved 1620 x g i 3 minutter og opsuges opløsningen ved hjælp af en vakuumpumpe og en Pasteur-pipette.
- Høst af sfæroider
- Brug en 1000 μL pipette til at pipette 500 μL komplet medium fast i brønden. Brug 500 μL medium fra brønden til at skylle brøndens fire kvadranter (specifikt den øverste, nederste, venstre og højre kvadrant) ved at pipettere op og ned i kvadranterne tre til fire gange for at løsne sfæroiderne. Sfærist forsigtigt mediet indeholdende sfæroider (~1000 μL i alt) i et mikrocentrifugerør ved hjælp af en 1000 μL pipette og lad sfæroiderne sætte sig til bunden.
- Supernatanten fjernes og sfæroiderne resuspenderes til den ønskede endelige koncentration. For eksempel, for at opnå ~8 sfæroider i en 20 μL gel efter indkapsling, resuspenderes sfæroiderne i 100 μL medier, hvilket giver en sfærisk koncentration på ~75 sfæroider/100 μL i sfæroidesuspensionen.
- Indkapsling af sfæroider i hydrogeler, som vist i figur 2.
- For at skabe 100 μL af en 10 % w/v PEG-hydrogelprækursoropløsning kombineres 50 μL af sfærooidsuspensionen efterfulgt af 30 μL 20 % w/v 4-armet PEG-Ac og endelig 20 μL 20 % w/v PEG-diSH i et mikrocentrifugeglas. Dette vil give et støkiometrisk molært forhold mellem acrylat (Ac) og thiol (SH) grupper, der sikrer optimal tværbinding. Bland gelforløberopløsningen ved pipettering op og ned ~ 10 gange.
BEMÆRK: Hydrogelsammensætning, volumen og polymersamordning kan ændres efter behov. De resulterende hydrogeler vil være langsomt nedbrydende og ikke-celleklæbende. For at fremstille hydrogelcelleklæbemidlet kan der tilsættes en klæbende ligand såsom RGDS. For at gøre hydrogelen enzymatisk nedbrydelig kunne der tilsættes en enzymatisk nedbrydelig peptidtværbinding indeholdende cysteinrester i begge ender. Ved overførsel af sfæroider pipetteres opløsningen forsigtigt to gange for at løsne sfæroider og bringe dem i suspension for at sikre jævn fordeling af sfæroider. - Der pipetteres 20 μL gelprækursoropløsning mellem to parafilmforede glasglas adskilt med 1 mm siliciumafstandsstykker, og objektglas med gelprækursoropløsning anbringes i 37 °C, 5 % CO2 -inkubator i 15 minutter for at muliggøre gelering.
BEMÆRK: Sørg for, at de to glasskinner er dækket af parafilm for at skabe en hydrofob overflade, der giver mulighed for let skrælning ved gelering. I stedet for parafilm kan en hydrofob belægningsopløsning anvendes. Et volumen på 20 μL hydrogelprecursoropløsning vil resultere i en hydrogelplade på ~ 6 mm i diameter og 1 mm i højden før hævelse. Enhver afstandstype og tykkelse kan anvendes, men det anbefales, at geltykkelsen holdes på eller under 1 mm (tykkere hydrogeler kan begrænse iltdiffusion og transport af næringsstoffer til cellerne), men større end sfæroiddiameteren (så sfæroider er fuldstændigt indkapslet i gelen). Ethvert volumen af hydrogelforløberopløsningen kan anvendes. 20-30 μL gelerne er velegnede til en plade med 24 brønde. - Når hydrogelgeleringen er afsluttet, adskilles de to glasglas og skræl forsigtigt gelerne af glaspladen ved hjælp af en spatel. Anbring gelerne i en plade med 24 brønde, en pr. brønd, og sørg for, at overfladen, der indeholder sfæroiderne, vender opad.
BEMÆRK: Sfæroider falder til bunden af gelen under gelering, så invertering af dem til dyrkning vil sikre, at sfæroiderne er nær hydrogelens overflade for bedre adgang til næringsstoffer og ilt. Gelering kan overvåges ved at observere enhver hydrogelforløberopløsning, der er tilbage i mikrocentrifugerøret og ikke bruges til at skabe plader ved at vende røret og notere det tidspunkt, hvor gelen holder op med at flyde. - Tilsæt komplet medium (~ 500 μL) til hvert hul, og sørg for, at hydrogelen er nedsænket helt. Multibrøndpladen anbringes i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5% CO2 og dyrkes cellerne med medieskift hver 2.-3. dag.
BEMÆRK: Hydrogels kan dyrkes i op til 4 uger, eller indtil hydrogelerne nedbrydes, skifter medie hver anden dag.
- For at skabe 100 μL af en 10 % w/v PEG-hydrogelprækursoropløsning kombineres 50 μL af sfærooidsuspensionen efterfulgt af 30 μL 20 % w/v 4-armet PEG-Ac og endelig 20 μL 20 % w/v PEG-diSH i et mikrocentrifugeglas. Dette vil give et støkiometrisk molært forhold mellem acrylat (Ac) og thiol (SH) grupper, der sikrer optimal tværbinding. Bland gelforløberopløsningen ved pipettering op og ned ~ 10 gange.
4. Fluorescerende farvning
- Celle levedygtighed
- Brug pletten 3,3'-dihexyloxacarbocyaniniodid (DiOC), som pletter mitokondrier og endoplasmatisk retikulum i alle celler, til at bestemme cellelevedygtighed. Brug DiOC (3 mM) i en koncentration på 0,02 μg/ml. Specifikt anvendes en 20 μL pipette til at tilsætte 2 μL DiOC pr. 1000 μL medie i kolben, der dyrker de dissocierede celler (mindst 24 timer før dannelsen af sfæroider i afsnit 3). Tillad 24 timer for DiOC at plette cellerne.
- Brug kerne- og kromosompletten, propidiumiodid, PI (1,50 mM), som kun kommer ind i døde celler. For at plette cellerne skal du først aspirere alle medier og skylle gelen ved hjælp af en 1000 μL pipette for at tilføje 500 μL 1x PBS, så gelen er helt nedsænket.
- PBS suges op, og der tilsættes 500 μL friske medier efterfulgt af 30 μL af PI-opløsningen til hvert hul (dvs. 6 μL pr. 100 μL medie). Dæk brøndpladen med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys. Brøndpladen anbringes i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 , og der henstår 30 minutter til, at PI pletter de døde celler.
- Fjern folien og aspirer medierne fra brøndene. Brug en 1000 μL pipette til at tilføje 500 μL 1x PBS for at nedsænke hydrogelen. Opsug 1x PBS og gentag skylningen to gange mere. Der tilsættes 500 μL medier til hvert hul og billede under et fluorescerende inverteret eller konfokalmikroskop.
- Beregn cellelevedygtigheden ved at sammenligne arealet af DiOC (alle celler) med PI (døde celler), som repræsenteret i ligning 1, ved hjælp af z-stack-billeder fra et konfokalmikroskop eller et inverteret fluorescerende mikroskop.
Eq. 1.
Eq. 1.5. Immunofluorescensfiksering, farvning, rydning og billeddannelse af indkapslede sfæroider
- Fastgørelse og farvning
- Opsug mediet fra brøndene, hvor hydrogelerne dyrkes, og skyl hydrogelerne ved at pipettere 500 μL 1x PBS direkte på hydrogelerne. Aspirer forsigtigt 1x PBS.
- Sfæroider fastgøres i 24-brøndpladen ved hjælp af en 1000 μL pipette for at tilføje 500 μL volumen fikseringsopløsning pr. Hul. Lad fikseringsmidlet trække gelerne i blød i 30 minutter ved RT. Fjern fikseringsopløsningen ved hjælp af en 1000 μL pipette og kassér i en udpeget affaldsbeholder.
- Skyl hydrogelerne ved at tilsætte 500 μL 1x PBS til hvert hul. Opsug 1x PBS ved hjælp af en 1000 μL pipette, og gentag PBS-skylningen yderligere to gange. Opbevar brøndpladen i 500 μL 1x PBS pr. hul ved 4 °C i op til 1 uge eller brug den straks.
BEMÆRK: Pas på ikke at trække hydrogelerne ind i pipetten, når du aspirerer PBS og fikseringsopløsning. Gør det ved at vippe pladen til en ~ 45 graders vinkel, hvilket vil hjælpe med at se hydrogelerne og forhindre utilsigtet aspiration.
FORSIGTIG: Formaldehyd er giftigt ved indånding og kontakt. Håndter med handsker i en kemisk stinkhætte. - For at plette cellerne inkuberes de hydrogelindkapslede sfæroider med primære antistoffer mod Nestin (200 μg/ml) og SOX2 (200 μg/ml) ved en fortynding på 1:200 antistof: PBS. Brug en 1000 μL pipette til at opsuge 1x PBS fra brøndene. Der tilsættes 50 μL af det fortyndede antistof til hvert hul. Lad farvningen være afsluttet i 24 timer. Fjern derefter farvningsopløsningen ved hjælp af en 1000 μL pipette og kassér affaldet korrekt.
- Brug en 1000 μL pipette til at tilføje 500 μL 1xPBS, hvilket er nok til at nedsænke hydrogelen. Aspirer PBS og gentag det to gange mere. Den farvede og nedsænkede hydrogel opbevares straks i 1x PBS ved 4 °C i op til 2 uger før billeddannelse eller billede.
BEMÆRK: Mindre optimeringer kan være nødvendige afhængigt af antistoffet for at sikre korrekt farvning. Koncentrationen (1:200) og tiden (24 timer) er signifikant højere end i typisk 2D-monolagscellekultur, fordi 3D-farvning kræver diffusion gennem hydrogelen og sfæroiderne.
- Efter farvning af sfæroider skal du rydde sfæroiden for at forbedre gennemsigtigheden til billeddannelse ved at erstatte PBS med en sekventiel koncentrationsforøgelse af formamid (valgfrit).
- Opsug 1x PBS fra hver brønd. Tilsæt 500 μL 20% (v/v) formamid til hvert hul og lad hydrogelen inkubere i 90 minutter. Opsug formamid ved hjælp af en 1000 μL pipette og saml affaldet i en affaldsbeholder.
- Tilsæt 500 μL 40% (v / v) formamid til brønden. Lad hydrogelen inkubere i opløsningen i 90 minutter. Opsug formamid og saml affaldet i affaldsbeholderen.
- Der tilsættes 500 μL 80% v/v formamid til hvert hul og inkuberes i 90 min. Opsug formamid og bortskaf i affaldsbeholderen. Der tilsættes 500 μL 100 % (v/v) formamid og tillades 24 timers inkubation før billeddannelse. Når rydningen er afsluttet, bortskaffes formamidaffald korrekt gennem de relevante tjenester i et laboratorieaffaldshåndteringssystem.
BEMÆRK: Rydning giver mulighed for konfokal billeddannelse i kernen af sfæroiden og er valgfri, hvis kun periferien af sfæroiden undersøges.
- Billeddannelse af hydrogelindkapslede sfæroider ved hjælp af konfokal mikroskopi.
BEMÆRK: Ethvert mikroskop - inverteret, fluorescerende eller konfokal - kan bruges til cellebilleddannelse; Imidlertid tillader konfokal isolering af enkeltplaner.- Placer hydrogelerne i kammerbrønde med glasdækbunde, og placer sfæroiderne så tæt på dæksedlen som muligt.
BEMÆRK: Glasdæksler eller kammerbrønde med glasdækbund kan bruges. Det er afgørende at holde hydrogeler hydreret, da dehydrerede prøver vil resultere i dårlig billedkvalitet. - Afbild prøverne med et mål med lang arbejdsafstand (10x-20x) for at muliggøre billeddannelse dybt ind i sfæroiden ved hjælp af Z-stakke til 3D-rekonstruktioner.
BEMÆRK: Højere forstørrelsesmål tillader mere detaljeret billedbehandling og optisk sektionering, men ofrer billeddybden. - Kvantificer mængden af signal, der er til stede i det optiske afsnit i forhold til det samlede areal af sfæroiden for både det ryddede og uklarede signal ved hjælp af ligning 2.
Eq. 2
- Placer hydrogelerne i kammerbrønde med glasdækbunde, og placer sfæroiderne så tæt på dæksedlen som muligt.
Eq. 2Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sfæroidbaserede lægemiddelscreeningsplatforme til undersøgelse af kemoterapeutiske virkninger er i stigende grad efterspurgte på grund af vægten på modulering af tumormikromiljøet ved sfærisk indkapsling i biomaterialer, der replikerer naturligt væv. Her udviklede vi en metode til flercellet tumorsfæroidpræparation og efterfølgende indkapsling og billeddannelse i en 3D-hydrogel. Sfæroiderne fremstilles i mikrobrøndforme (figur 3A, B), hvilket resulterer i sfæroider med sfæriske former og tæt kontrolleret polydispersitet. For eksempel for sfæroider med 3.300 celler pr. mikrobrønd var den gennemsnitlige sfæroidstørrelse ~ 250 μm, og cirkularitet var >0,8, hvor 1 er en perfekt kugle (figur 3C, D). Den procentvise varianskoefficient (%CV) for sfærisk diameter var 19,3%, og %CV for cirkularitet var 4,5%. Sfæroiddiametre var afhængige af antallet af celler pr. mikrobrønd, som vist i tabel 1. Bemærk, at nogle celler i mikrobrøndene muligvis ikke er inkorporeret i sfæroiden og vil blive vasket af under sfærohøstningstrinnet.
Sfæroiden kan afbildes ved forskellige Z-stack-dybder, hvilket giver mulighed for cellelevedygtighed for hvert sted inden for Z-stakken (figur 4). Bemærk, at på grund af konfokale billeddannelsesbegrænsninger og den høje celletæthed kunne den sfæroidiske kerne ikke afbildes fuldt ud. Som diskuteret senere kan sfærisk rydning eller sektionering være nødvendig for forbedret billeddannelse i hele sfæroiden. Gennem denne metode blev sfæroidlevedygtigheden bestemt til at være høj (~ 90%) umiddelbart efter høst og indkapsling, selvom cellelevedygtigheden dykkede lidt til 85% i sfæroidekernen sammenlignet med periferien. For at sikre levedygtighed i hele sfæroiden blev sfæroider dissocieret under anvendelse af akutase, og levedygtigheden af de dissocierede celler blev beregnet ved hjælp af samme metode og viste sig at være lige høj (>90%). En maksimal projektion ved hjælp af sfæroidestakken repræsenterer det højeste punkt for lysintensitet inden for hvert sted af Z-stakken komprimeret til et billede (figur 4B).
Repræsentative billeder af fritflydende sfæroider (ingen gel) og indkapslede sfæroider (PEG-gel) farvet til stilkhedsmarkører Nestin og SOX2 er vist i figur 5. Nestin er et mellemliggende filament og en stamcellemarkør til stede i gliomer. SOX2 er en transkriptionsfaktor for selvfornyelse, også til stede i gliomer. SOX2 viste sig at være co-lokaliseret med DAPI i kernen, mens Nestin var til stede i cellerne. Dataene viser ingen forskel mellem gelen og ingen gelbetingelser, muligvis på grund af at PEG-gelen, der anvendes her, er inert og ikke letter cellematrixinteraktioner gennem integrinsignalering.
En væsentlig begrænsning af billeddannelse er den høje sfæroidtæthed, hvilket gør det vanskeligt at afbilde i sfæroidkernen. Almindelige metoder til at afbilde den sfæroidiske kerne inkluderer sektionering og rydning af sektionerne. Dette kan fungere godt med fritflydende sfæroider, men sektionering af hydrogeler er vanskelig, og de fleste vævsrydning involverer dehydrerende prøver, hvilket resulterer i deformerede prøver. Her tilpassede vi en protokol fra Kuwajima et al.28 til hydrogelprøver for at opretholde sfæroidstrukturen, mens de stadig rydder sfæroiderne. For at demonstrere nytten af clearingmetoden blev sfæroider fikseret, farvet med PI og ryddet (figur 6). Figur 6A viser repræsentative billeder af optiske sektioner ved ~90 μm i ryddede og ikke-ryddede sfæroider og det samlede areal af sfæroiden, når sfæroidområdet er fyldt. Når rydningen blev udført, kunne den sfæroidiske kerne afbildes ~ 30 μm dybere sammenlignet med en uryddet sfærisk (figur 6B). Clearing kan være meget gavnligt for immunofluorescens, da den rumlige organisering af biomarkører kan analyseres i kernen af sfæroider. Denne metode kan kun bruges til faste prøver, da membranintegriteten forstyrres.
Figur 1: PDMS skimmelfabrikation og sfærisk dannelse. PDMS-forløberopløsninger tilsættes til firkantede pyramidale mikrobrøndplader til dannelse af PDMS-forme. Den dissocierede cellesuspension tilsættes til de dannede PMDS-forme og spindes ned for at muliggøre sfærisk dannelse efter 24 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Indkapsling, dyrkning og billeddannelse af hydrogel. (A) 4-armet PEG-Ac, PEG diSH og sfæroidesuspensionen kombineres i et mikrocentrifugerør og (B) blandes godt ved pipettering op og ned for at danne en gelprækursoropløsning. C) 20 μL af gelprækursoropløsningen pipetteres på et glasglas, og en anden glasglas anbringes oven på opløsningen og adskilles af 1 mm afstandsstykker. (D) Hydrogel overføres til 24 brøndplader med sfæroider opad og dækkes med medier (500 μL). (E) Hydrogel overføres til et glasdæksel til mikroskopibilleddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sfæroiddannelse i mikrobrønde før høst, 24 timer efter indledende cellesåning i mikrobrøndene. (A) Sfæroider i mikrobrønd farvet med DiOC (grøn). Skalabjælken er 200 μm. (B) Brightfield-billede af sfæroider i mikrobrønde. C) Histogram med kuglediameter i mikrobrønde. D) Histogram af kuglecirkularitet i mikrobrønde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativt Z-stack konfokal billede af levende sfæroid til levende død analyse. (A) Billeder fra 4 skiver Z-stack med DiOC (grøn) og PI (rød). Skalabjælken er 200 μm. (B) Maks. projektion af Z-Stack. (C) Cellelevedygtighed som funktion af sfærisk dybde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Nestin og SOX2 immunfarvning af fritflydende (ingen gel) og hydrogelindkapslet (PEG gel) U87 cellesfæroider på dag 5 af kulturen. Repræsentative konfokale billeder af sfæroiderne bekræfter Nestin (rød) og SOX2 (grøn) udtryk, som blev modfarvet med DAPI (blå; kerne). Skalabjælken er 100 μm. Billeder beskåret og zoomet fra den hvide firkant viser forholdet mellem kernen (blå) og SOX2 (grøn). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Billeddybde af ryddede sfæroider. (A) Repræsentative billeder af sfæroider afbildet ved 91,6 μm ind i det sfæroidiske og samlede sfæroidområde. (B) Procentdel af det sfæroide område, der afbildes, når dybden i sfæroid øges. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mikrobrønd størrelse (μm) | Antal celler pr. sfærisk | Antal celler pr. brønd | Cellekoncentration (celler/ml) | Sfærisk diameter (μm) |
| 400 | 200 | 120000 | 240000 | 115,4 ± 13,5 |
| 500 | 300000 | 600000 | 144,6 ± 14,3 | |
| 1000 | 600000 | 1200000 | 176,5 ± 12,5 | |
| 800 | 2000 | 300000 | 600000 | 212,4 ± 15,7 |
| 3000 | 450000 | 900000 | 258,9 ± 16,3 | |
| 4000 | 600000 | 1200000 | 305,7 ± 21,6 | |
| 5000 | 750000 | 1500000 | 323,4 ± 29,8 |
Tabel 1: Speroid diameter og mikrobrøndstørrelse. Det beregnede antal celler pr. sfæroide, antal celler pr. brønd i en 48-brøndplade, cellekoncentration og resulterende sfærisk diameter afhængigt af mikrobrøndstørrelsen af den negative PDMS-form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydrogelbaserede multicellulære tumorsfæroidmodeller udvikles i stigende grad for at fremme kræftterapeutiske opdagelser 11,13,29. De er gavnlige, fordi de efterligner nøgleparametre i tumormikromiljøet på en kontrolleret måde og på trods af deres kompleksitet er enklere og billigere at bruge end in vivo-modeller, og mange er kompatible med screeningsteknologier med høj kapacitet. Hydrogelbiomaterialerne kan indstilles til at efterligne tumorens ekstracellulære matrix og lette cellematrixinteraktioner, og sfæroiden (i modsætning til dissocierede celler) emulerer celle-celle-interaktionerne mellem den indfødte tumor. Syntetiske hydrogeler, som demonstreret her, er særligt fordelagtige, fordi hydrogelen giver den ønskede strukturelle støtte og fysiske og mekaniske egenskaber, mens klæbende ligander eller nedbrydelige sekvenser kan bruges til uafhængigt at indstille biokemiske materialeegenskaber. Syntetiske hydrogeler tilbyder også lavere batch-til-batch-variabilitet og større materialeegenskaber, der omfatter de fleste bløde væv i kroppen.
Her beskriver vi detaljeret brugen af en inert PEG-baseret hydrogel, der dannes via Michael-type tilsætning som beskrevet tidligere25,30. Den repræsentative PEG-hydrogel, der anvendes her, har Youngs modul på ~ 8 kPa, svarende til glioblastomvævsstivhed9. PEG-hydrogelen er praktisk, da den har justerbare egenskaber og meget specifik geleringskemi og kan dannes i nærvær af sfæroider uden at gå på kompromis med cellelevedygtigheden (figur 4). Mens PEG-hydrogelen er inert og fungerer som cellestilladser med definerede fysiske og mekaniske egenskaber, kan celleklæbende ligander tilsættes for at guide celle-matrix-interaktioner, og enzymatisk nedbrydelige peptidtværbindinger kan tilsættes for at hjælpe matrix remodellering9. Selvklæbende ligander og peptidtværbindinger kunne vælges til at efterligne det cellulære mikromiljø for at tilføje fysiologisk eller patologisk relevans til modellen. For flere detaljer om PEG-hydrogelmodifikationer for at indstille hydrogelnedbrydelighed, mekaniske egenskaber og klæbeevne, henvises læserne til følgende offentliggjorte arbejde 9,27.
Ved hjælp af metoden beskrevet her kan store mængder kræftsfæroider dannes hurtigt og indkapsles i PEG-hydrogelen for at undersøge effekten af substrategenskaber på sfærisk cellelevedygtighed, morfologi eller cellestamme (figur 4 og figur 5), blandt andre egenskaber. Cellerne får først lov til at aggregere og danne en sfærisk og derefter indkapslet i hydrogelerne, som vist i figur 2 og figur 3. Aggregeringsprocessen gør det muligt at variere sfæroidstørrelserne baseret på størrelsen af mikrobrøndformene og koncentrationen af cellesuspensionen pipetteret ind i mikrobrøndformene (tabel 1). De resulterende sfæroider er relativt monodisperse i størrelse med en gennemsnitlig varianskoefficient på ~ 10% -20% for alle forhold. Dette er gavnligt for en række applikationer, da lignende størrelser vil udvise lignende diffusionsbegrænsninger, det være sig af stoffer, næringsstoffer eller ilt, ind i sfæroiden. Sfæroiderne har også en cirkularitet på >0,8, hvilket kan sammenlignes med andre ultra-lave fastgørelses- eller hængende dråbemetoder31. Bemærk, at andre metoder til sfærisk dannelse kan anvendes først, såsom hængende dråbemetoden eller roterende cellekultursystem32, og derefter indkapslet i hydrogelen. Den metode, der er beskrevet her, kræver imidlertid ikke noget specialudstyr eller dyre forbrugsvarer, hvilket hjælper med tilgængelighed for alle laboratorier.
Mens metoderne vist her bruger U87-MG glioblastomcellelinjen, kan den beskrevne sfæroidfabrikations- og indkapslingsmetode anvendes til forskellige kræftcelletyper, der danner faste tumorer. Hvis cellerne ikke let aggregeres til dannelse af en sfæroide, kan en blanding af ECM-proteiner, såsom en kældermembranmatrix, tilsættes til cellesuspensionen for at hjælpe processen (som beskrevet i metoderne). Når sfæroider er indkapslet, er det bedst at blive afbildet og analyseret direkte i hydrogelen i stedet for at blive ekstraheret fra hydrogelen eller cellerne, der dissocieres. Dette skyldes, at sfæroider typisk er heterogene (f.eks. Kan en hypoxisk kerne dannes på grund af ilt- og næringsgradienter), og celleresponser vil variere afhængigt af positionen inden for sfæroiden. Celleekstraktion kan også skjule cellematrixinteraktionernes rolle på sfærisk skæbne. For eksempel har vi tidligere vist, at celler i den kugleformede periferi versus kerne har forskellig respons over for kemoterapeutika, hvilket yderligere afhænger af substratets mekaniske egenskaber27. Derfor anbefaler vi at bruge mikroskopiteknikker til undersøgelse af sfærisk adfærd, som fremhævet i dette manuskript.
Et spørgsmål at overveje, når man billeddannelse af tætte væv som sfæroider er deres opacitet. Her beskriver vi en rydningsmetode til forbedring af billedbarheden gennem det indre af sfæroiden (figur 6). Men selvom sfæroidrydning hjælper med at maksimere billeddybden, kan der findes begrænsninger, når de indkapslede sfæroider placeres i formamid, hvilket resulterer i potentiel strukturel skade og påvirker sfærisk billeddannelse. Denne proces kan heller ikke udføres, når man observerer cellelevedygtighed gennem levende / død farvning, fordi rydning kræver fiksering. Rydningsprocessen kræver også flere timers inkubation i formamid efter farvning, så det kan potentielt påvirke de anvendte farvestoffer. Andre teknikker, såsom kryosektionering og derefter immunfarvning, kan også fungere, forudsat at sektioneringen ikke forvrænger eller kompromitterer sfærisk vævsintegritet. I vores hænder resulterede kryosektionering i "klemt" sfæroider på grund af hydrogelens blødhed, som er ~ 8 kPa i Youngs modul, for at efterligne glioblastomvævsstivhed.
Samlet set er de kritiske trin i denne protokol vellykket sfærisk fabrikation, hydrogelindkapsling og kultur og sfærisk billeddannelse og analyse; Derfor har vi leveret noter og fejlfindingsstrategier til disse trin. De hydrogelindkapslede sfæroider, der er beskrevet her, kan anvendes i en række forskellige applikationer, såsom lægemiddelscreeningsplatforme, detaljerede undersøgelser af cellematrixinteraktioner og deres virkning på celleadfærd, undersøgelser af sygdomsætiologi osv. Sådanne undersøgelser kan hjælpes af tunbarheden af det beskrevne system som diskuteret ovenfor og de forudsigelige og kontrollerbare egenskaber af den syntetiske PEG-hydrogel. Nogle begrænsninger i det beskrevne system inkluderer en medium gennemstrømning, hvor høj gennemstrømning foretrækkes til multiplex- eller højvolumenundersøgelser såsom lægemiddelscreening. En anden begrænsning er behovet for billeddannelse, såsom konfokal billeddannelse, til dataanalyse. Mens billeddannelse giver mulighed for detaljeret speciel og tidsmæssig analyse, er det også tidskrævende og hindret af penetrationsbegrænsninger på grund af dybde og sfærisk celletæthed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af opstartsmidler til Dr. Silviya P Zustiak af Saint Louis University samt af et frøtilskud fra Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience ved Saint Louis University tildelt Dr. Silviya P Zustiak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| 24-Well Plate Ultra Low Attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| 35 mm Petri Dish | Amazon | 706011 | |
| 4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 6-well AggreWell 400 | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 34421 | Square pyramidal microwells |
| anti-adherence rinsing solution | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | Cat #: 07010 | |
| Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free | Corning | 356234 | Basement membrane matrix |
| Detergent - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Nonionic surfactant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
| Hydrophobic solution - Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) | Fisher Scientific | D1125 | |
| Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Plastic Weigh Boats (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
| poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | Polydimethylsiloxane |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln. | Fisher Scientific | AAJ66584AB | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Triethanolamine, ≥99.0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG human glioblastoma cells | American Type Culture Collection | HTB-14 |
References
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417 (2018).
- Li, Y., Kumacheva, E. Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening. Science Advances. 4 (4), eaas8998 (2018).
- Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids. Polymers. 12 (11), 2506 (2020).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).
- Pedron, S., et al. Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens. Biomaterials. 219, 119371 (2019).
- Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids. Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).
- Chen, J. -W. E., et al. Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346 (2020).
- Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling. Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980 (2018).
- Shin, S., et al. Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation. RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture. Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).
- Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells. PLoS One. 14 (1), e0211078 (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665 (2013).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).
- Zhao, L., et al. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Scientific Reports. 9 (1), 19717 (2019).
- Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
- Gencoglu, M. F., et al. Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).
- Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. Mechanical properties of brain tissue based on microstructure. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924 (2021).
- Alifieris, C., Trafalis, D. T. Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment. Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).
- Kroger, S. M., et al. Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation. Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085 (2020).
- Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).
- Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels. Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics. MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).
- Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948 (2016).
- Lee, K. -H., Kim, T. -H. Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening. Biosensors. 11 (11), 445 (2021).
