Безметочный биоанализ комбинационного рассеяния комбинационного рассеяния без меток на основе Au@Carbon-точечных нанозондов
Summary
В этом исследовании мы разработали недорогой поверхностно-усиленный нанозонд на основе комбинационного рассеяния света (SERS) с благоприятной биосовместимостью, чтобы показать биовизуализацию живых клеток без меток и обнаружить два бактериальных штамма, подробно показывая, как получить спектры SERS живых клеток неразрушающим методом.
Abstract
Технология комбинационного рассеяния с поверхностным усилением (SERS) привлекает все больше внимания в области биомедицины из-за ее способности предоставлять информацию о молекулярных отпечатках биологических образцов, а также из-за ее потенциала в анализе отдельных клеток. Целью данной работы является разработка простой стратегии безметочного биоанализа SERS на основе Au@carbon-точечных нанозондов (Au@CDs). Здесь CD, полученные из полифенолов, используются в качестве восстановителя для быстрого синтеза наноструктур Au@CD оболочки ядра, что обеспечивает высокую производительность SERS даже при низкой концентрации метиленового синего (MB) 10-9 М благодаря кооперативному механизму усиления комбинационного рассеяния. Для биоанализа Au@CDs может служить уникальным наносенсором SERS для идентификации клеточных компонентов биообразцов (например, раковых клеток и бактерий). Молекулярные отпечатки различных видов могут быть дополнительно различимы после объединения с анализом главных компонентов. Кроме того, Au@CDs также позволяет получать изображения SERS без меток для анализа профилей внутриклеточного состава. Эта стратегия предлагает осуществимый биоанализ SERS без меток, открывая новые перспективы для нанодиагностики.
Introduction
Анализ отдельных клеток необходим для изучения выявления клеточной гетерогенности и оценки комплексного состояния клетки. Мгновенная реакция клетки на микроокружение также требует анализа одной клетки1. Тем не менее, существуют некоторые ограничения для существующих методов. Флуоресцентное детектирование может быть применено к анализу отдельных клеток, но оно ограничено низкой чувствительностью. Другие проблемы возникают из-за сложного флуоресцентного фона клеток и флуоресцентного фотообесцвечивания при длительном облучении2. Поверхностно-усиленное комбинационное рассеяние света (SERS) может быть квалифицировано с точки зрения анализа отдельных клеток благодаря своим преимуществам, в том числе (1) отражению внутренней молекулярной информации отпечатков пальцев и мгновенной ситуации, (2) сверхвысокой поверхностной чувствительности, (3) удобному мультиплексному обнаружению, (4) высокой фотостабильности, (5) обнаружению можно количественно оценить для сравнительного анализа, (6) предотвращению клеточной автофлуоресценции с возбуждением длины волны NIR, (7) обнаружение может быть выполнено в клеточной водной среде окружающей среды, и (8) обнаружение может быть направлено на конкретную область в ячейке 3,4,5.
Существует два общепризнанных механизма, позволяющих понять SERS как фундаментальное явление: электромагнитное усиление (ЭМ) как доминирующую причину и химическое усиление (ХМ). ЭМ относится к колебаниям коллективных электронов, вызванным электромагнитными волнами, когда частота падающего света совпадает с частотой свободных электронов, колеблющихся в металле, что приводит к возникновению поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Когда локализованное SPR (LSPR) происходит за счет падающего лазерного удара по металлическим наночастицам (НЧ), это приводит к резонансному поглощению или рассеянию падающего света. Следовательно, напряженность поверхностного электромагнитного поля металлических НЧ может быть увеличена на два-пять порядков4. Тем не менее, ключом к огромному улучшению SERS является не один металлический NP, а зазор между двумя NP, который создает горячие точки. КМ генерируется с двух сторон, включая (1) взаимодействия между молекулами-мишенями и металлическими НЧ и (2) способность молекул-мишеней переносить электроны в/из металлических НЧ 4,5. Более подробную информацию можно найти в этих обзорных статьях 4,5. В предыдущей литературе было представлено несколько перспективных методов биозондирования и визуализации SERS в живых клетках, например, обнаружение апоптотических клеток6, белков в органеллах7, внутриклеточных микроРНК8, клеточных липидных мембран9,цитокинов10 и метаболитов11 в живых клетках, а также идентификация и мониторинг клеток с помощью конфокальной SERS визуализации2, 11,12,13. Интересно, что безметочный SERS представляет собой уникальное преимущество SERS, который может описывать внутренние молекулярные спектры5.
Основной проблемой для безметочных SERS является рациональная и надежная подложка. Типичными подложками SERS являются НЧ из благородных металлов из-за их превосходной способности рассеивать много света14. В настоящее время все больше внимания уделяется нанокомпозитам из-за их замечательных физико-химических свойств и биосовместимости. Что еще более важно, нанокомпозиты могут демонстрировать лучшую активность SERS из-за интенсивного электромагнитного излучения, индуцированного горячими точками на наногибридах, и дополнительного химического усиления, происходящего от других неметаллических материалов15. Например, Fei et al. использовали квантовые точки MoS 2(QD) в качестве редукторов для синтеза нанокомпозитов AuNP@MoS 2 QD для безметочной визуализации SERS в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) клеток рака молочной железы мышей 4T1 (клеток 4T1)16. Кроме того, Li et al. изготовили подложку 2D SERS, состоящую из нанолистов Au NP и 2D нанолистов дителлурида гафния для безметочных измерений SERS патогенных бактерий пищевого происхождения17. В последнее время углеродные точки (CD), хорошие доноры электронов, используются в качестве восстановителей без других восстановителей или облучения для синтеза Au@carbon точечных нанозондов (Au@CDs)18, которые, как сообщается, являются эффективными материалами для повышения активности SERS на основе эффекта переноса заряда (CT) между ядрами Au и оболочками CD19,20. Более того, CD признаны в качестве укупорочного агента и стабилизатора, предотвращающего агрегацию Au NP21. Кроме того, он открывает больше возможностей для реакций с аналитами, так как может обеспечить большое количество связывающих и активных сайтов20. Воспользовавшись вышеизложенным, Jin et al. разработали быстрый и контролируемый метод изготовления Ag@CD НЧ с уникальными свойствами SERS и превосходной каталитической активностью для мониторинга гетерогенных каталитических реакций в режиме реального времени18.
В данной работе был продемонстрирован простой и малозатратный метод изготовления субстратов Au@CD SERS для идентификации клеточных компонентов и биовизуализации живых клеток SERS без меток, а также для обнаружения и дифференциации Escherichia coli (E. coli) и Staphylococcus aureus (S. aureus), который является перспективным для ранней диагностики заболеваний и лучшего понимания клеточных процессов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Таким образом, Au@CDs с ультратонкой оболочкой CD 2,1 нм были успешно изготовлены. Нанокомпозиты демонстрируют более высокую чувствительность к SERS, чем чистые НЧ Au. Кроме того, Au@CDs обладают отличными характеристиками воспроизводимости и долговременной стабильности. Дальнейшие исследовани?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32071399 и 62175071), Научно-технической программой Гуанчжоу (2019050001), Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (2021A1515011988) и Открытым фондом Ключевой лаборатории оптоэлектронной науки и техники для медицины (Фуцзяньский педагогический университет) Министерства образования Китая (JYG2009).
Materials
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
Riferimenti
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al. Understanding SERS of bacteria. Journal of Raman Spectroscopy. 40 (3), 277-288 (2009).
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman spectroscopy of biological tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42 (5), 493-541 (2007).
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q. Core-shell nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy. Chemical Reviews. 117 (7), 5002-5069 (2017).
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
