Phänotypisches Profiling von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen dopaminergen Neuronen im Mittelhirn

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Zellkultivierung menschlicher dopaminerger Neuronen im Mittelhirn, gefolgt von immunologischen Färbungen und der Generierung neuronaler phänotypischer Profile aus aufgenommenen mikroskopischen High-Content-Bildern, die die Identifizierung phänotypischer Variationen aufgrund genetischer oder chemischer Modulationen ermöglichen.

Abstract

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist mit einer Reihe zellbiologischer Prozesse verbunden, die den Verlust von dopaminergen (mDA) Neuronen im Mittelhirn verursachen. Vielen aktuellen In-vitro-PD-Zellmodellen mangelt es an Komplexität und sie berücksichtigen nicht mehrere Phänotypen. Phänotypisches Profiling in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten mDA-Neuronen kann diese Mängel beheben, indem gleichzeitig eine Reihe von neuronalen Phänotypen in einem Parkinson-relevanten Zelltyp parallel gemessen wird. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung und Analyse phänotypischer Profile von kommerziell erhältlichen humanen mDA-Neuronen. Ein neuronenspezifisches Fluoreszenz-Färbepanel wird verwendet, um die mit Kern, α-Synuclein, Tyrosinhydroxylase (TH) und Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 (MAP2) verwandten Phänotypen zu visualisieren. Das beschriebene phänotypische Profilierungsprotokoll ist skalierbar, da es 384-Well-Platten, automatisches Liquid Handling und Hochdurchsatzmikroskopie verwendet. Der Nutzen des Protokolls wird anhand gesunder mDA-Neuronen von Spendern und mDA-Neuronen veranschaulicht, die die PD-verknüpfte G2019S-Mutation im Gen für die Leucin-reiche Repeat-Kinase 2 (LRRK2) tragen. Beide Zelllinien wurden mit dem LRRK2-Kinase-Inhibitor PFE-360 behandelt und phänotypische Veränderungen gemessen. Darüber hinaus zeigen wir, wie multidimensionale phänotypische Profile mit Hilfe von Clustering oder maschinellem Lernen gesteuerten überwachten Klassifikationsmethoden analysiert werden können. Das beschriebene Protokoll wird besonders für Forscher interessant sein, die an der Modellierung neuronaler Krankheiten arbeiten oder die Wirkung chemischer Verbindungen in menschlichen Neuronen untersuchen.

Introduction

Bei der Parkinson-Krankheit (PD) sind verschiedene zellbiologische Prozesse gestört. Zum Beispiel wurden mitochondriale Dysfunktion, oxidativer Stress, Proteinabbaudefekte, Störung des vesikulären Transports und der endolysosomalen Funktion mit dem Verlust von dopaminergen (mDA) Neuronen im Mittelhirn in Verbindung gebracht, die häufig bei PD¹ beobachtet werden. Daher scheint Parkinson mehrere Krankheitsmechanismen zu beinhalten, die miteinander interagieren und sich gegenseitig verschlimmern können. Eine nützliche Möglichkeit, dieses mechanistische Zusammenspiel zu untersuchen, ist die Erstellung eines umfassenden phänotypischen Fingerabdrucks oder Profils von dopaminergen (mDA) Neuronen im Mittelhirn.

Phänotypisches Profiling ist ein Ansatz, bei dem ein Profil einer Stichprobe auf der Grundlage einer Sammlung messbarer Merkmale erstellt wird, und zweitens werden auf der Grundlage dieses Profils Vorhersagen über eine Stichprobe getroffen ^2,3. Das Ziel der Profilerstellung ist es, eine Vielzahl von Merkmalen zu erfassen, von denen einige zuvor möglicherweise nicht mit einer Krankheit oder Behandlung in Verbindung gebracht wurden³. Infolgedessen kann das Profiling unerwartete biologische Prozesse aufdecken. Die Erstellung von phänotypischen Profilen beruht in der Regel auf fluoreszenzgefärbten Zellen, und standardisierte Assays, wie z. B. Cell Painting, wurden entwickelt, um phänotypische Profile zu erstellen⁴. In jüngster Zeit wird phänotypisches Profiling beispielsweise für die Charakterisierung kleiner Moleküle oder die genaue Vorhersage von PD-Subtypen ausschließlich auf der Grundlage von patienteneigenen Fibroblasten eingesetzt ^5,6. Trotz dieser Fortschritte wurde die phänotypische Profilerstellung bisher nur selten auf post-mitotisch differenzierte Zellen angewendet, wie z. B. von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete mDA-Neuronen, die PD-assoziierte Mutationen wie LRRK2 G2019S exprimieren. Zu den wesentlichen Herausforderungen von iPSC-abgeleiteten Modellen gehören das Vorhandensein subtiler oder variabler pathologischer Merkmale über Differenzierungschargen oder Genotypen hinweg und die Tatsache, dass isolierte PD-Phänotypen nicht die volle Komplexität der Krankheit erfassen. Darüber hinaus sind neuronale iPSC-Modelle zwar physiologisch relevant, werden aber aufgrund von Bedenken hinsichtlich der technischen Komplexität nur selten in der PD-Wirkstoffforschung eingesetzt ^7,8.

Wir haben zuvor eine robuste Methodik entwickelt, um mehrere Parkinson-bedingte pathophysiologische Phänotypen in menschlichen mDA-Neuronen zu messen, die sowohl empfindlich auf genetische als auch auf durch chemische Verbindungen induzierte phänotypische Veränderungen reagieren⁹. Dieser Artikel beschreibt detailliert eine weiter optimierte Version dieser Methodik, um phänotypische Profile aus mDA-Neuronen zu erstellen (Abbildung 1). Dieses Protokoll hat mehrere Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen phänotypischen Profiling-Ansätzen, wie z.B. die Verwendung hochwertiger mDA-Neuronen und die technische Reproduzierbarkeit. Dieses Protokoll ermöglicht zum ersten Mal ein phänotypisches Profiling in physiologisch relevanten post-mitotischen mDA-Neuronen nach chemischen Störungen in einer hochskalierbaren Weise. Vollständig differenzierte und kryokonservierte mDA-Neuronen sind kommerziell erhältlich, wodurch die Variabilität der Differenzierung von Charge zu Charge erheblich verringert wird. Zweitens kann die technische Variabilität durch ein klar definiertes Versuchsdesign (d. h. Kulturdauer oder Vermeidung von Randvertiefungen), automatisiertes Liquid Handling und automatisierte Mikroskopie weiter reduziert werden. Darüber hinaus werden hier die ersten Schritte der phänotypischen Profilanalyse unter Verwendung von unüberwachtem Clustering oder überwachten Klassifikationsansätzen skizziert, die zeigen, wie phänotypische Profiling-Daten analysiert werden können. Dieses Protokoll wird für Forscher von Nutzen sein, die sich für phänotypische Veränderungen von mDA-Neuronen interessieren, die durch genetische oder chemische Störungen induziert werden, insbesondere wenn ein hochgradig skalierbarer Studienaufbau erforderlich ist, z. B. bei Screening-Kampagnen oder wenn die Wirkung einer kleineren Anzahl von Verbindungen untersucht werden soll, z. B. um toxische Wirkungen zu bestimmen. Zusammenfassend wird erwartet, dass die Anwendung des phänotypischen Profilings menschlicher Neuronen eine wertvolle Technik ist, um komplexe krankheitsbedingte Phänotypen zu untersuchen und die zellulären Effekte von Wirkstoffkandidaten zu charakterisieren.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls zur Generierung bildbasierter phänotypischer Profile aus humanen iPSC-abgeleiteten mDA-Neuronen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Vorbereitung des Mediums und der Platten für das Neuronen-Seeding (Tag 1) Um die Platten für die Aussaat der Neuronen an Tag 1 vorzubereiten, erwärmen Sie Laminin kurz vor der Anwendung auf Raumtemperatur (RT). Bereiten Sie die Lamininlösung vor, indem Sie die Laminin-Stammlösung (0,1 mg/ml) 1/10 in kaltem PBS+/+ (mit Ca 2+ und Mg2+) verdünnen.HINWEIS: Alle Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Zusammensetzung von Lösungen u…

Representative Results

Das phänotypische Profiling in mDA-Neuronen ist ein effizienter Weg, um mehrere Aspekte der Zellbiologie und ihre Veränderungen während der experimentellen Modulation zu quantifizieren. Um diese Methodik zu veranschaulichen, wurden in dieser Studie kryokonservierte LRRK2 G2019S und gesunde Spender-mDA-Neuronen verwendet. Diese Neuronen wurden seit ca. 37 Tagen differenziert, sind postmitotisch und exprimieren neuronale Marker (TUBB3 und MAP2) und dopaminerge Neuronenmarker, einschließlich Tyrosinhydroxylase (TH) in K…

Discussion

Phänotypisches Profiling ist eine Technik zur Messung einer großen Anzahl von Phänotypen in Zellen durch Fluoreszenzfärbungen, Mikroskopie und Bildanalyse³. Phänotypische Profile können über Zelllinien oder andere experimentelle Bedingungen hinweg erstellt und verglichen werden, um komplexe Veränderungen in der Zellbiologie zu verstehen, die bei Verwendung einer einzigen Auslesung möglicherweise unbemerkt bleiben. Hier beschreiben wir die Anwendung von phänotypischem Profiling auf humane…

Materials

Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse – Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit – Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.