मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न मिडब्रेन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव मिडब्रेन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के सेल संवर्धन का वर्णन करता है, इसके बाद इम्यूनोलॉजिकल धुंधलापन और अधिग्रहित सूक्ष्म उच्च-सामग्री छवियों से न्यूरोनल फेनोटाइपिक प्रोफाइल की पीढ़ी आनुवंशिक या रासायनिक मॉड्यूलेशन के कारण फेनोटाइपिक विविधताओं की पहचान की अनुमति देती है।

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला से जुड़ा हुआ है जो मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन हानि का कारण बनता है। कई वर्तमान इन विट्रो पीडी सेलुलर मॉडल में जटिलता की कमी होती है और कई फेनोटाइप को ध्यान में नहीं रखते हैं। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग समानांतर में पीडी-प्रासंगिक सेल प्रकार में न्यूरोनल फेनोटाइप ्स की एक श्रृंखला को एक साथ मापकर इन कमियों को संबोधित कर सकती है। यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव एमडीए न्यूरॉन्स से फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक न्यूरॉन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट स्टेनिंग पैनल का उपयोग परमाणु, α-सिन्यूक्लिन, टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच), और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) से संबंधित फेनोटाइप की कल्पना करने के लिए किया जाता है। वर्णित फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग प्रोटोकॉल स्केलेबल है क्योंकि यह 384-वेल प्लेट्स, स्वचालित तरल हैंडलिंग और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल की उपयोगिता को स्वस्थ दाता एमडीए न्यूरॉन्स और एमडीए न्यूरॉन्स का उपयोग करके उदाहरण दिया जाता है जो ल्यूसीन-समृद्ध रिपीट काइनेज 2 (एलआरआरके 2) जीन में पीडी-लिंक्ड जी 2019 एस उत्परिवर्तन ले जाते हैं। दोनों सेल लाइनों को एलआरआरके 2 किनेज अवरोधक पीएफई -360 के साथ इलाज किया गया था और फेनोटाइपिक परिवर्तनों को मापा गया था। इसके अतिरिक्त, हम प्रदर्शित करते हैं कि क्लस्टरिंग या मशीन लर्निंग-संचालित पर्यवेक्षित वर्गीकरण विधियों का उपयोग करके बहुआयामी फेनोटाइपिक प्रोफाइल का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है। वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से न्यूरोनल रोग मॉडलिंग पर काम करने वाले शोधकर्ताओं या मानव न्यूरॉन्स में रासायनिक यौगिक प्रभावों का अध्ययन करने में रुचि रखेगा।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) में विभिन्न प्रकार की कोशिका जैविक प्रक्रियाएं परेशान होती हैं। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, ऑक्सीडेटिव तनाव, प्रोटीन क्षरण दोष, वेसिकुलर तस्करी का विघटन और एंडोलाइसोसोमल फ़ंक्शन मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन हानि से जुड़े हुए हैं, आमतौर पर पीडी¹ में देखे जाते हैं। इसलिए, पीडी में कई रोग तंत्र शामिल होते हैं जो एक दूसरे के साथ बातचीत कर सकते हैं और खराब कर सकते हैं। इस यंत्रवत अंतःक्रिया की जांच करने का एक उपयोगी तरीका एक व्यापक फेनोटाइपिक फिंगरप्रिंट या मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स की प्रोफ़ाइल का निर्माण है।

फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग एक दृष्टिकोण है जिसमें मापने योग्य विशेषताओं के संग्रह के आधार पर एक नमूने की प्रोफ़ाइल बनाना शामिल है, और दूसरा, इसमें इस प्रोफ़ाइल ^2,3 के आधार पर एक नमूने के बारे में भविष्यवाणियां करना शामिल है। प्रोफाइलिंग का लक्ष्य सुविधाओं की एक विविध श्रृंखला को पकड़ना है, जिनमें से कुछ पहले किसी बीमारी या उपचार से जुड़े नहीं हो सकते^हैं। नतीजतन, प्रोफाइलिंग अप्रत्याशित जैविक प्रक्रियाओं को प्रकट कर सकती है। फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग आमतौर पर फ्लोरोसेंटली दाग वाली कोशिकाओं पर निर्भर करती है, और फेनोटाइपिक प्रोफाइल⁴ बनाने के लिए सेल पेंटिंग जैसे मानकीकृत परख विकसित किए गए हैं। हाल ही में, फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग, उदाहरण के लिए, छोटे अणुओं के लक्षण वर्णन या पीडी-उपप्रकारों की सटीक भविष्यवाणी के लिए पूरी तरह से रोगी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट ^5,6 के आधार पर लागू किया गया है। इन प्रगति के बावजूद, फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग शायद ही कभी पोस्ट-माइटोटिक विभेदित कोशिकाओं पर लागू की गई है, जैसे कि मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स जो पीडी-लिंक्ड म्यूटेशन जैसे एलआरआरके 2 जी 2019 एस को व्यक्त करते हैं। आईपीएससी-व्युत्पन्न मॉडल की महत्वपूर्ण चुनौतियों में भेदभाव बैचों या जीनोटाइप में सूक्ष्म या परिवर्तनीय पैथोलॉजिकल विशेषताओं की उपस्थिति शामिल है, और यह तथ्य कि पृथक पीडी फेनोटाइप रोग की पूरी जटिलता को कैप्चर नहीं करते हैं। इसके अलावा, जबकि आईपीएससी न्यूरोनल मॉडल शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, तकनीकी जटिलता ^7,8 के बारे में चिंताओं के कारण पीडी दवा खोज प्रक्रियाओं में उनका उपयोग शायद ही कभी किया जाता है।

हमने पहले मानव एमडीए न्यूरॉन्स में कई पीडी-संबंधित पैथोफिजियोलॉजिकल फेनोटाइप ्स को मापने के लिए एक मजबूत पद्धति विकसित की थी जो आनुवंशिक और रासायनिक यौगिक-प्रेरित फेनोटाइपिक^{परिवर्तनों के} प्रति संवेदनशील हैं। यह लेख एमडीए न्यूरॉन्स (चित्रा 1) से फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने के लिए इस पद्धति के एक और अनुकूलित संस्करण का विस्तार से वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में पहले वर्णित फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग दृष्टिकोणों पर कई फायदे हैं, जैसे कि उच्च गुणवत्ता वाले एमडीए न्यूरॉन्स और तकनीकी प्रजनन क्षमता का उपयोग। पहली बार, यह प्रोटोकॉल अत्यधिक स्केलेबल फैशन में रासायनिक गड़बड़ी के बाद शारीरिक रूप से प्रासंगिक पोस्ट-माइटोटिक एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है। पूरी तरह से विभेदित और क्रायोसंरक्षित एमडीए न्यूरॉन्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो बैच-टू-बैच भेदभाव परिवर्तनशीलता को काफी कम करते हैं। दूसरे, तकनीकी परिवर्तनशीलता को एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रयोगात्मक डिजाइन (यानी, संस्कृति अवधि या किनारे के कुओं से बचने), स्वचालित तरल हैंडलिंग और स्वचालित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और कम किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, असुरक्षित क्लस्टरिंग या पर्यवेक्षित वर्गीकरण दृष्टिकोण का उपयोग करके फेनोटाइपिक प्रोफाइल विश्लेषण के प्रारंभिक चरणों को यहां उल्लिखित किया गया है, यह दर्शाता है कि फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग डेटा का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक या रासायनिक गड़बड़ी से प्रेरित एमडीए न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक परिवर्तनों में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोग का होगा, विशेष रूप से जब एक अत्यधिक स्केलेबल अध्ययन सेटअप की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, स्क्रीनिंग अभियानों के दौरान या जब कम संख्या में यौगिकों के प्रभावों का अध्ययन किया जाना है, उदाहरण के लिए, विषाक्त प्रभाव निर्धारित करने के लिए। सारांश में, यह अनुमान लगाया गया है कि मानव न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग का आवेदन जटिल रोग से संबंधित फेनोटाइप का अध्ययन करने और दवा उम्मीदवारों के सेलुलर प्रभावों को चिह्नित करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक है।

चित्रा 1: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स से छवि-आधारित फेनोटाइपिक प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. न्यूरॉन सीडिंग के लिए मध्यम और प्लेटों की तैयारी (दिन 1) पहले दिन न्यूरॉन सीडिंग के लिए प्लेटों को तैयार करने के लिए, उपयोग से ठीक पहले लैमिनिन को कमरे के तापमान (आरटी) पर गर्म करें। ठंडे पीबीएस…

Representative Results

एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग प्रयोगात्मक मॉड्यूलेशन के दौरान सेलुलर जीव विज्ञान और उनके परिवर्तनों के कई पहलुओं को निर्धारित करने का एक कुशल तरीका है। इस पद्धति का उदाहरण देने के लिए, …

Discussion

फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग फ्लोरोसेंट स्टेनिंग, माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण³ को लागू करके कोशिकाओं में बड़ी संख्या में फेनोटाइप को मापने की एक तकनीक है। फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्राप्त किए जा स?…

Materials

Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse – Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit – Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.