Summary
Здесь мы описываем протоколы для трех типов культур эксплантации кожи эмбрионов птиц, которые могут быть использованы для изучения тканевых взаимодействий, 4D-визуализации таймлапс-пленки (3D плюс время), глобальных или локальных возмущений молекулярной функции и характеристик системной биологии.
Abstract
Развивающаяся птичья кожа во время эмбриогенеза является уникальной моделью, которая может дать ценную информацию о структуре тканей. Здесь описаны три вариации культур эксплантов кожи для изучения различных аспектов развития кожи. Во-первых, культивирование органов ex vivo и манипуляции с ними дают исследователям возможность наблюдать и изучать развитие перьевых почек напрямую. Культура кожных эксплантов может расти в течение 7 дней, что позволяет проводить прямой анализ клеточного поведения и получать 4D-визуализацию с интервалами в течение этого периода роста. Это также позволяет проводить физические и молекулярные манипуляции с условиями культивирования для визуализации реакции тканей. Например, бусины, покрытые фактором роста, могут наноситься локально, чтобы вызвать изменения в рисунке перьев на ограниченной площади. В качестве альтернативы, вирусная трансдукция может быть доставлена глобально в питательных средах для повышения или понижения экспрессии генов. Во-вторых, протокол рекомбинации кожи позволяет исследователям исследовать тканевые взаимодействия между эпидермисом и мезенхимой, которые происходят из разных областей кожи, разных этапов жизни или разных видов. Это дает возможность проверить временное окно, в течение которого эпителий способен реагировать на сигналы, и его способность формировать различные придатки кожи в ответ на сигналы от различных мезенхимальных источников. В-третьих, восстановление кожи с использованием диссоциированных дермальных клеток, покрытых интактным эпителием, обнуляет развитие кожи и позволяет изучить начальные процессы периодического формирования паттернов. Этот подход также расширяет наши возможности по манипулированию экспрессией генов среди диссоциированных клеток перед созданием восстановленного кожного экспланта. В этой статье представлены три протокола культивирования и примеры экспериментов, демонстрирующие их полезность.
Introduction
Развитие кожи птичьего эмбриона является отличной моделью для изучения механизмов морфогенеза из-за его особенностей и доступности к микрохирургии и манипуляциям 1,2. Тем не менее, оценка клеточных и молекулярных событий в интактных тканях может быть затруднена, потому что присутствие посторонних тканей может усложнить микроскопические наблюдения. Кроме того, способность манипулировать экспрессией генов для проверки их роли в морфогенезе кожи не всегда является простой задачей. Мы обнаружили, что можем проверить функции генов с помощью ретровирусной трансдукции с более высоким уровнем успеха на моделях эксплантов кожи. В этой статье мы обсудим преимущества трех разработанных моделей эксплантов кожи.
Культура эмбриональной кожи птиц является мощной системой для оценки поведения клеток, регуляции генов и функций во время развития перьевых почек кожи 3,4,5,6. Это позволяет оценить молекулярные механизмы развития перьевых почек за счет глобального добавления факторов роста, помещенных в питательные среды, или их локального высвобождения из гранул, покрытых факторами роста. Регуляторные гены развития также могут быть манипулированы с помощью вирусной трансдукции интактных или доминантных негативных форм для функциональных исследований, оценивая их роль в конкретных морфогенетических событиях 7,8.
Культура эпителиально-мезенхимальной рекомбинации птиц позволяет исследователям определить вклад каждого компонента кожи на ранних стадиях морфогенеза кожи. Использование Роулзом этого подхода показало, что взаимодействие между мезенхимой и эпителием имеет важное значение для формирования придатков кожи9. Мезенхима может образовывать конденсации, а эпителий необходим для индукции и поддержания образования мезенхимальной конденсации2. Позже этот подход был использован для оценки того, почему бесчешуйчатые куры не могут формировать перья. Обнаружено, что дефект находится в мезенхиме10. Дуайи проводил исследования тканевой эпителиально-мезенхимальной рекомбинации у эмбрионов разных видов. Эти исследования позволили получить представление о развитии и эволюции эпителиально-мезенхимальных коммуникаций, которые способствуют морфогенезу кожи3.
Это исследование было использовано для лучшего понимания факторов, контролирующих рост перьев. Метод также улучшает визуализацию клеточных и молекулярных событий, участвующих в формировании кожного рисунка, которые происходят во время зарождения, развития и удлинения перьев вдоль передне-задней оси. Когда эпителий отделяется от мезенхимы и два компонента затем рекомбинируются, новые взаимодействия восстанавливают структуру кожи. Этот подход позволяет оценить мезенхимальные индуцирующие сигналы и молекулы эпителиальной компетентности, которые позволяют эпидермису реагировать на мезенхимальные сигналы11. Последующая молекулярная экспрессия, необходимая для развития перьевых почек и формирования узоров, также может быть изучена. Эти исследования установили, что расположение бутонов контролируется мезенхимой. Вращение эпителия на 90° до рекомбинации с мезенхимой показывает, что направление удлинения перьевого зачатка контролируется эпителием. Этот метод был необходим для изучения молекулярного механизма, регулирующего ориентацию перьевых почек12.
Культура восстановления птичьей кожи, в которой мезенхима кожи перед нанесением диссоциирована на отдельные клетки при высокой плотности клеток и покрыта неповрежденным эпителием, сбрасывает клетки дермы в исходное состояние. Затем эксплант самоорганизуется, образуя новый периодический паттерн, независимый от предыдущих сигналов13. Эта модель восстановления кожи может быть использована для изучения начальных процессов периодического формирования перьев. Мы использовали этот подход для изучения того, как модуляция соотношения мезенхимальных клеток к одному кусочку эпителия может влиять на размер или количество перьевых почек. Было обнаружено, что количество почек увеличивается, но не размер почек, поскольку соотношение мезенхимальных клеток увеличивается. Еще одним преимуществом этого подхода является то, что вирусная трансдукция мезенхимальных клеток показывает более высокую эффективность, чем в двух других условиях культивирования, и может продуцировать более очевидные фенотипы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура экспланта куриной кожи (рисунок 1)
- Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и устанавливают их в соответствии с Hamburger и Hamilton14.
- На стадии 28 (~E5.5) второй палец и третий палец конечности длиннее остальных; Три пальца и четыре пальца на ногах различимы.
- На стадии 29 (~E6) крыло согнуто в локте; Вторая цифра заметно длиннее остальных.
- На стадии 30 (~E6.5) два ряда зачатков спинного пера по обе стороны от спинного мозга видны на уровне плечевой кости, а три ряда видны на уровне ног.
- На стадии 31 (~E7) имеется ~7 рядов перьев на юмбо-крестцовых уровнях.
- На стадии 32 на уровне ног присутствует одиннадцать и более рядов перьевых почек.
- Поместите куриный эмбрион стадии 28-32 в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую буферизованный солевой раствор Хэнкса (HBSS) или фосфатно-солевой буфер (PBS).
- Рассеките спинную кожу эмбриона между нижней частью шеи и областью хвоста. С помощью ножниц снимите голову с шеи. Осторожно потяните за бутоны конечностей, расположив брюшную сторону тела вниз, а придатки распространить наружу.
- Сделайте передний и задний разрез на коже вдоль двух боковых сторон тела эмбриона с помощью часовых щипцов или острых пружинных ножниц. Обязательно нужно стабилизировать тело с помощью пары щипцов, прищипывая зачатки конечностей в продольном направлении. Аккуратно отшелушите кожу от шеи к области хвоста или от хвоста к шее с помощью часовых щипцов.
- Аккуратно удалите подкожные ткани, которые остаются прикрепленными к отслоившейся коже, и разгладьте края кожи острыми пружинными ножницами.
- Добавьте 2 мл/лунку модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и раствором пенициллина/стрептомицина (разбавленным 1:100) в лунку в 6-луночной чашке. После добавления среды и антибиотиков поместите внутрь лунки стерильный вкладыш для культуры тканей таким образом, чтобы среда находилась на внешней стороне вкладыша для культуры.
- Перенесите кожу шпателем во вставку для культуры эпидермисом вверх и мезенхимой вниз на мембране вставки. Чтобы кожа лежала ровно без складок, натяните кожу на шпатель в HBSS. Снимите кожу со шпателя с жидкостью, чтобы облегчить перенос кожи без сворачивания.
- Удалите избыток HBSS из вкладыша для культивирования с помощью пипетки объемом 200 мкл. Оставьте тонкий слой HBSS внутри питательной вставки, чтобы эксплант оставался полувлажным и обеспечивал воздушно-жидкостную границу соприкосновения.
- Инкубируйте культуры эксплантации кожицы при 37 °C с использованием 5%CO2 и 95% воздуха. Меняйте среду каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура была опубликована4. Эту систему культивирования можно использовать и с кожей других птиц, таких как перепелиные или зябликовые культуры.
2. Эпителиально-мезенхимальная рекомбинация кожи курицы (Рисунок 2)
- Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и помещают эмбрионы в соответствии с Hamburger и Hamilton14 (раздел 1.1).
- Приготовьте 2x солевой раствор без кальция и магния (CMF) с 0,25% этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
- Приготовьте 10x CMF буфер (NaCl (1,37 M) 80 г, KCl (0,04 M) 3 г,2PO4 (0,004 M) 0,5 г, KH2PO4 (2 M) 0,25 г, NaHCO3 (0,12 M) 10 г, глюкозу (0,1 M) 20 г в 1 000 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,3. Чтобы получить 100 мл 2x CMF с 0,25% буфером EDTA, EDTA сначала следует растворить в 80 мл дистиллированной воды, затем добавить 20 мл 10x CMF буфера, чтобы получить 2x CMF с 0,25% рабочим раствором EDTA.
- Препарируйте спинную кожу куриных эмбрионов стадии 30-32 в HBSS, как описано выше (раздел 1.2), и инкубируйте их в 2x CMF физиологическом растворе с 0,25% ЭДТА на льду в течение 15-20 минут.
- Аккуратно отделите эпителий и мезенхиму с помощью часовых щипцов. Переложите отделенный эпителий и мезенхиму в чистую посуду, содержащую HBSS.
- Повторно комбинируйте эпителий с мезенхимой, сначала поместив мезенхиму на чашку Петри, содержащую HBSS, затем поместите эпителий поверх мезенхимы. Поместите эпителий вдоль той же передне-задней оси, что и мезенхима, или поверните эпителий на 90° от передне-задней оси мезенхимы, чтобы определить, какой компонент регулирует различные аспекты морфогенеза кожи.
- Переложите рекомбинированную кожуру во вкладыши для культуры в 6-луночные чашки для выращивания и удалите избыток HBSS вокруг рекомбинированной кожи.
- Поместите 2 мл питательной среды DMEM с 10% FBS в лунку снаружи вкладыша. Поместите тонкий слой DMEM внутрь камеры вставки, чтобы эксплант оставался полувлажным и обеспечивал воздушно-жидкостную границу.
- Кожные рекомбинанты инкубируют при 37 °C в смеси 5%CO2 и 95% воздуха. Меняйте среду каждые 2 дня. Документирование фенотипических изменений в начальных фазах развития кожи с помощью покадровой фотосъемки с помощью камеры, установленной на препарирующем микроскопе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура была опубликована11.
3. Восстановление куриной кожи (Рисунок 3)
- Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и помещают эмбрионы в соответствии с Hamburger и Hamilton14 (раздел 1.1).
- Препарирование спинной кожи куриного эмбриона стадии 30-33 в HBSS. Инкубируйте шкуру в 2x CMF физиологическом растворе с 0,25% ЭДТА на льду в течение 15-20 минут, как описано выше (раздел 2.3).
- Аккуратно отделите эпителий и мезенхиму с помощью часовых щипцов. Перенесите отделенный эпителий и мезенхиму в HBSS на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить базальный слой эпителия при отделении эпителия от мезенхимы. - Отделенную мезенхиму соберите в центрифужную пробирку объемом 15 мл и инкубируйте с 0,1% раствором коллагеназы/трипсина, приготовленным в PBS, на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут.
- Диссоциируйте мезенхиму кожи с помощью пипетки Пастера, чтобы получилась одноклеточная суспензия. Добавьте DMEM с 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.
- Гранулируйте и центрифугируйте ячейки при 233 × г в течение 5 минут. Ресуспендировали клетки питательной средой в концентрации от 2 ×10 до 7 клеток/мл.
Примечание: На этом этапе мезенхимальные клетки также могут быть ресуспендированы в вируссодержащей среде на 2-3 ч на льду для трансдукции генов. - Поместите вкладыш для клеточной культуры в одну лунку 6-луночной чашки. Капните 10 мкл 2 × 107 клеток/мл мезенхимальных клеток на вкладыш для культуры тканей. Поместите 2 мл питательной среды DMEM с 10% FBS в лунку снаружи вкладыша. Инкубируйте пластинчатые мезенхимальные клетки при 37 °C с использованием 5%CO2 и 95% воздуха в течение 1 ч, чтобы клетки осядли на мембране вставки.
- Перенесите интактный эпителий поверх покрытой мезенхимальной капли слоем базальных клеток эпителия, обращенным к мезенхимальным клеткам, с помощью пипетки объемом 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе эпителия в мезенхимальную каплю мезенхимальные клетки не должны быть нарушены. - Расплющите неповрежденный эпителий над мезенхимой, чтобы восстановленная кожа эксплантировалась. Оставьте тонкий слой среды на вкладыше, чтобы восстановленный эксплант кожи оставался полувлажным и обеспечивал воздушно-жидкостную границу. Инкубируйте восстановленный эксплант кожи при 37 °C в воздушном инкубаторе с 5%CO2 и 95% концентрацией. Меняйте среду каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура была опубликована13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Культуры кожных эксплантов
Развитие перьевых почек из культур кожных органов ex vivo можно непосредственно наблюдать под микроскопом. Используя модель культуры экспланта кожи цыплят стадии 30 дорсальной кожи, плакоды видны вдоль средней линии. Затем морфогенетический фронт постепенно распространяется латерально к периферии кожи с образованием новых перьевых зачатков. Эти перьевые зачатки разовьются в короткие перьевые почки через 2 дня в культуре и длинные перьевые почки через 4 дня в культуре (Рисунок 1).
Культуры для рекомбинации кожи
При рекомбинации кожи, когда эпителий и мезенхима рекомбинируются, первоначальные плакоды исчезают. Новые плакоды появляются вскоре после рекомбинации и развиваются с образованием коротких перьевых почек и длинных перьевых почек через 2 и 4 дня в культуре соответственно. Если эпителий повернут на 90° относительно мезенхимы, ориентация удлиненных почек будет определяться эпителием (рис. 2).
Культуры для восстановления кожи
Для восстановления кожи культуры органов ex vivo сначала выглядят однородными, а затем одновременно через 1 сутки в культуре образуются кожные конденсаты с равномерным расстоянием. Следует отметить, что количество перьевых почек зависит от количества мезенхимальных клеток. Более низкое число мезенхимы привело к образованию11 почек аналогичного размера. Короткие перьевые почки образуются через 2-3 дня в культуре, а длинные перьевые бутоны образуются через 4-5 дней в культуре (Рисунок 3).
На рисунке 4 представлены сводные диаграммы культуры органов кожи ex vivo , культуры органов рекомбинации кожи и культуры органов восстановления кожи.
Рисунок 1: Культура кожных органов ex vivo . Кожу куриного эмбриона стадии 32 препарируют в HBSS и культивируют в 6-луночных культуральных вставках (T0, в момент времени 0) в течение 2 и 4 дней. Перьевые зачатки развиваются в короткие перьевые почки через 2 дня в культуре и длинные перьевые почки через 4 дня в культуре. Дермальные плакоды обозначены белой стрелкой. Обратите внимание, что бутоны на средней линии более зрелые, чем на обеих боковых сторонах. Этот метод был модифицирован по сравнению с Цзяном и Чуонгом4. Масштабная линейка = 500 мкм. Аббревиатура: HBSS = буферизованный солевой раствор Хэнка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Культура органов рекомбинации кожи ex vivo . Кожу куриного эмбриона 32 стадии препарируют в HBSS, а эпителий и мезенхимальный отделяют в буфере 2x CMF. Эпителий кожи и мезенхима рекомбинируют с вращением или без него и культивируют в течение 2 дней и 4 дней. Новые плакоды развиваются в короткие и длинные перьевые почки через 2 и 4 дня в культуре. Если эпителий повернут на 90° относительно мезенхимы, ориентация новых почек определяется по эпителию12. Этот метод был модифицирован из Chuong et al.11. Масштабная линейка = 500 мкм. Аббревиатура: CMF = без кальция и магния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Культура органов для восстановления кожи ex vivo . Кожа куриного эмбриона 32 стадии рассекается, и эпителий и мезенхима разделяются в буфере 2x CMF. Мезенхиму диссоциируют на отдельные клетки 0,1% коллагеназы и трипсина и гранулируют при высокой плотности клеток на культуральной вставке. Гранулу дермальных клеток восстанавливают с помощью интактного эпителия (T0, в момент времени 0) и культивируют в течение 6 ч, 2 дней и 5 дней. Экспланты сначала появляются однородными (6 ч), а затем через 1 сутки в культуре одновременно образуются кожные конденсаты с равномерными интервалами. Короткие перьевые бутоны образуются через 2-3 дня в культуре, а длинные перьевые бутоны образуются через 4-5 дней в культуре. Этот метод был модифицирован по сравнению с Jiang et al.13. Масштабная линейка = 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Диаграммы моделей культуры органов кожи ex vivo. Кожа начинается с уровня E6,5 в виде одного слоя эпителия, покрывающего мезенхимальные клетки. Это изображено в верхней части трех методов экспланта. (А) Культура кожных органов ex vivo. Кожица наносится в неповрежденном виде на верхнюю часть питательной вставки на границе раздела воздух: среда при 37 °C в воздушном инкубаторе с 5% CO2 и 95%СО2. (B) Культура органов рекомбинации кожи ex vivo. Эпителий кожи отделяют от мезенхимы, а затем рекомбинируют перед нанесением на вставку клеточной культуры на границе раздела воздух: среда при 37 °C в воздушном инкубаторе с 5%CO2 и 95% воздухом. (C) Культура органов для восстановления кожи ex vivo. Эпителий кожи отделяется от мезенхимы. Затем мезенхиму диссоциируют в одноклеточную суспензию, а мезенхимальные клетки гранулируют в центрифуге. Затем мезенхимальные клетки ресуспендируют в концентрации 2 × 10,7 клеток/мл и 10 мкл суспензии, помещают на вкладыш для культуры, а затем накладывают на них неповрежденный кусочек эпидермиса. Культура инкубируется на воздухе: интерфейс среды при 37 °C в воздушном инкубаторе с 5%CO2 и 95% воздухом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Дополнительный рисунок S1: Трансдукция мезенхимных клеток вирусом, экспрессирующим GFP. Диссоциированные мезенхимальные клетки (2 × 10,7 клеток/мл) инкубировали в течение 3 ч на льду с вирусом птичьей саркомы >10,7 инфекционных единиц/мл, экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP). Затем мезенхимальные клетки использовали для формирования восстановленных культур органов кожи, как описано в разделе 3 протокола выше, и фотографировали через 24 часа. Данные показывают, что ~40% мезенхимальных клеток были помечены GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рекомбинация тканей обеспечивает анализ для изучения уникального вклада эпителия и мезенхимы. У цыплят перья начинают развиваться на эмбриональный день 7 (Е7), в то время как чешуя начинается на Е9. Когда чешуйчатая мезенхима Е9 рекомбинируется с перьевым эпителием Е7, рекомбинированная ткань образует чешуйки, а когда мезенхима пера Е7 рекомбинируется с чешуйчатым эпителием Е9, перья образуются11. Эти исследования показали, что мезенхима контролирует расстояние между формированиями узоров и идентичность органов. Конечно, эпителий должен быть компетентным, чтобы иметь возможность принимать и интерпретировать мезенхимальные сигналы соответствующим образом. Компетентность существует в эпителии только в течение короткого промежутка времени. В отличие от вышеуказанных результатов, удивительно, что при рекомбинации слизистой оболочки полости рта курицы и аборального эпителия Е5 с мезенхимой туловища Е8 аборальный эпителий образует перья; Однако слизистая оболочка полости рта образует множественные зубоподобные придатки15. Это показывает, что в то время как мезенхима кожного туловища направляет аборальный эпителий на производство перьев, оральный эпителий не имеет способности производить перья и может производить только зубы. Эпителий полости рта в этом исследовании, возможно, уже был задействован в формировании зубов в точке Е5. Гибридизация in situ , РНК-скоп и иммуноокрашивание могут быть использованы для подтверждения молекулярной экспрессии в рекомбинированных эксплантах для проверки идентичности образующихся тканей. С помощью этого анализа возмущения могут быть целенаправленно направлены на эпителий или мезенхиму.
Восстановление тканей сбрасывает клетки внутри мезенхимы в незафиксированное состояние. Перьевая кожа Е7-Е8 начала образовывать мезенхимальные конденсации в дорсальных путях до того, как кожа диссоциировалась и мезенхима диссоциировалась на отдельные клетки. Путем маркировки эпителиальных или мезенхимальных клеток в первичном зачатке или межбутонных областях, дермальные клетки могут быть обнаружены внутри или снаружи почек независимо от их предыдущего расположения. При низкой плотности мезенхимальных клеток восстановленные кожные экспланты образуют несколько перьевых почек нормального размера. По мере увеличения плотности мезенхимальных клеток количество шишек увеличивается до тех пор, пока не будет достигнута максимальная плотность упаковки13. Эти данные указывают на то, что клетки перепрограммируются за счет потери контакта со своими первоначальными соседями и претерпевают новый раунд формирования паттернов. У этих культур также развиваются конденсации и перьевые зачатки. Интересно, что бутоны образуются одновременно по всей коже, в отличие от прогрессивного размножения бутонов, наблюдаемого у кожных эксплантов и рекомбинированных кожных эксплантов. Этот метод позволяет наблюдать и манипулировать клеточными и молекулярными взаимодействиями кожи на ранних стадиях. Молекулярная экспрессия может быть оценена в культуре с помощью промоторно-репортерного анализа. Восстановление между трансгенными или нокаутными линиями может помочь в дальнейшем анализе роли молекул в процессе формирования рисунка кожи. Вирусная трансдукция усиливается в диссоциированных мезенхимальных клетках и часто может вызывать повышенное возмущение.
При этом каждый из этих экспериментальных подходов может помочь исследователям изучить клеточные и молекулярные события, происходящие во время морфогенеза кожи. Мы часто используем каждый из этих подходов и смотрим, какой из них дает наилучшие идеи. Полученные результаты могут быть дополнительно изучены в других условиях культивирования или с использованием интактных эмбрионов.
Ограничения этих подходов
Каждый из этих трех анализов дает высоковоспроизводимые результаты. Однако, поскольку эти анализы могут реагировать на одно и то же возмущение в разной степени, часто имеет смысл изменять условия с использованием всех трех анализов, если изначально не было обнаружено никаких изменений. Несмотря на то, что культура кожного экспланта является хорошей моделью для раннего формирования кожного рисунка и развития кожного придатка, эксплант можно культивировать только в течение ~1 недели. Это исключает их использование в более позднем развитии придатков кожи, например, в процессе формирования дермального сосочка и морфогенеза фолликулов, хотя процедуры совершенствуются для более длительного культивирования этих эксплантов. На сегодняшний день, на ранних этапах после проведения восстановленных эксплантов кожи, клетки слабо прикрепляются к своим субстратам, что затрудняет анализы с использованием нескольких промывок, таких как гибридизация in situ . Эти культуры более прочно связывают свои субстраты к 24 часам, в течение которых по всей культуре образуются конденсаты.
Кожа эмбриона птицы является отличной моделью для изучения развития кожных придатков. Преимущества культур кожных эксплантов заключаются в том, что они позволяют манипулировать культурами культивирования, в которых произрастают культуры кожных органов ex vivo. Это также позволяет проводить долгосрочную покадровую съемку развития, чтобы увидеть распространение бутонов от средней линии к боковым краям с течением времени. Кроме того, культуру можно начинать выращивать с использованием различных эмбриональных стадий для изучения различных событий в формировании и росте перьев. Для периодического формирования рисунка кожу можно культивировать, начиная с E6, и культивировать в течение 4 дней. Для морфогенеза перьевых фолликулов культуру можно начинать с E8 и культивировать в течение 4 дней. На стадиях, предшествующих Е6, трудно рассекать кожу. При использовании культур эксплантов глобальные нарушения могут быть вызваны добавлением факторов роста или ингибиторов в культуральную среду для эксплантов кожи 8,16,17. Локальное возмущение кожи может быть достигнуто путем размещения покрытых белком гранул на кожном экспланте или путем вирусной трансдуцирующей клетки для модуляции экспрессии генов 8,16,17. Эксплантные культуры облегчают визуализацию коллективного поведения клеток, таких как активность кальция6, и приложение биофизических сил, таких как напряжение тканей18 или электрические токи12. Эти методы открывают широкие возможности для того, чтобы по-новому взглянуть на факторы, которые регулируют периодическое структурирование органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа поддержана грантами NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 и RO1 AR078050. Работа также поддерживается совместным исследовательским контрактом между Университетом Южной Калифорнии и Китайским медицинским университетом на Тайване. Мы благодарим класс USC BISC 480 Developmental Biology 2023 за успешное тестирование этого протокола культивирования птичьей кожи в течение нескольких лабораторных модулей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
