Método de imobilização vertical para análise de microscopia time-lapse em cianobactérias filamentosas

Summary

Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.

Abstract

Um evento principal na divisão celular bacteriana é o processo de septação, onde a proteína FtsZ é o elemento chave. O FtsZ polimeriza-se formando uma estrutura semelhante a um anel (anel Z) no meio da célula que serve de arcabouço para outras proteínas de divisão. A microscopia de super-resolução em modelos bacterianos de Escherichia coli e Bacillus subtilis mostrou que o anel Z é descontínuo, enquanto estudos de imagem de células vivas demonstraram que o FtsZ se move ao longo do anel por um mecanismo conhecido como esteira. Para estudar a dinâmica da FtsZ in vivo, uma colocação especial de células em posição vertical é necessária para obter imagens da estrutura completa do anel no plano XY. No caso da imagem por FtsZ em cianobactérias multicelulares, como Anabaena sp.PCC7120, manter os filamentos em posição vertical é um desafio devido ao tamanho das células e ao comprimento dos filamentos. Neste artigo, descrevemos um método que permite a imobilização vertical de filamentos de Anabaena sp., PCC 7120, usando agarose de baixo ponto de fusão e seringas, para registrar o anel Z em um mutante que expressa uma proteína de fusão FtsZ-sfGFP. Este método é uma maneira rápida e barata de registrar a dinâmica de proteínas no local de divisão usando microscopia confocal.

Introduction

A divisão celular bacteriana é o processo no qual uma célula-mãe gera duas células-filhas, na maioria dos casos pelo mecanismo conhecido como fissão binária. Um dos eventos mais precoces no processo de septação é a localização de FtsZ no meio da célula¹. Essa proteína, estruturalmente homóloga à tubulina², é conservada e amplamente distribuída na maioria das bactérias, e sua polimerização gera uma estrutura contrátil conhecida como anel Z³. Este anel serve como um andaime para outras proteínas de divisão e juntos eles formam uma maquinaria molecular chamada divisome. Vários estudos têm demonstrado que o anel Z é altamente dinâmico e que os protofilamentos FtsZ se movem por esteira ^4,5,6. Para estudar o anel Z em experimentos de lapso de tempo, é aconselhável registrar o local de divisão no plano XY para melhor resolução e amostragem rápida. Para isso, é necessário desenvolver métodos de imobilização celular vertical que comumente incluam a nanofabricação de armadilhas celulares de microfuros e dispositivos microfluídicos complexos⁷.

Cianobactérias são microrganismos fotossintéticos classificados como gram-negativos por sua morfologia celular. Entretanto, filogeneticamente estão mais próximas de bactérias^{gram-positivas8}. Esses organismos possuem genes de divisão celular que são comuns dentro de bactérias gram-positivas e gram-negativas, mas seu divisômio também contém elementos únicos⁹. PCC 7120 (doravante Anabaena sp.) é cianobactéria filamentosa com um plano de divisão e é um modelo para o estudo da divisão celular em cianobactérias multicelulares. Nessa linhagem, foi possível determinar o posicionamento da FtsZ no meio das células¹⁰. No entanto, não há estudos mostrando a dinâmica in vivo da FtsZ neste modelo. Em nosso laboratório, através de acasalamento triparental e recombinação homóloga, obtivemos um mutante totalmente segregado de Anabaena sp., que expressa a proteína FtsZ fusionada à sfGFP, que substituiu o gene ftsZ endógeno completo. Desenvolvemos um método rápido e simples de imobilização celular que favorece a orientação vertical dos filamentos de deformação mutantes para experimentos de time-lapse para visualizar a divisão de proteínas em cianobactérias filamentosas. Este método não necessita de dispositivos microfluídicos que podem ser caros e difíceis de desenvolver. Como exemplo, usamos este protocolo para visualizar o anel Z no mutante FtsZ-sfGFP por microscopia confocal.

Protocol

1. Considerações e seleção do modelo celular NOTA: As cianobactérias têm uma forte autofluorescência devido à presença de pigmentos fotossintéticos. Este sinal está na parte vermelha do espectro, portanto, as proteínas fluorescentes adequadas para imageamento em cianobactérias são as que estão longe da emissão vermelha. Por exemplo, GFP, YFP, Vênus, Turquesa e BFP. Selecione um componente divisômico presente na cepa de cianobactéria filamentosa alv…

Representative Results

Visualização do anel Z em Anabaena sp., pelo método de imobilização verticalPara estudar a dinâmica dos componentes do anel Z em bactérias, é necessário adquirir imagens em células orientadas verticalmente. Nesta posição, é possível visualizar o anel Z e as principais proteínas do divisômio para monitorar a dinâmica proteica por microscopia de lapso de tempo. A preparação clássica de amostras para bactérias não funciona para cianobactérias filamentosas. No caso de …

Discussion

O estudo da dinâmica das proteínas divisômicas é, sem dúvida, um desafio. Particularmente, nas cianobactérias filamentosas, um dos desafios é a visualização do anel Z no plano horizontal, para o qual as células devem ser orientadas verticalmente. O método aqui descrito permite o posicionamento do anel Z no plano XY para realizar as diferentes análises. Este é o primeiro método simples para cianobactérias filamentosas que permite a visualização completa do anel Z.

Embora este …

Materials

1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	–	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	–	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	–	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.