Summary
Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.
Abstract
Um evento principal na divisão celular bacteriana é o processo de septação, onde a proteína FtsZ é o elemento chave. O FtsZ polimeriza-se formando uma estrutura semelhante a um anel (anel Z) no meio da célula que serve de arcabouço para outras proteínas de divisão. A microscopia de super-resolução em modelos bacterianos de Escherichia coli e Bacillus subtilis mostrou que o anel Z é descontínuo, enquanto estudos de imagem de células vivas demonstraram que o FtsZ se move ao longo do anel por um mecanismo conhecido como esteira. Para estudar a dinâmica da FtsZ in vivo, uma colocação especial de células em posição vertical é necessária para obter imagens da estrutura completa do anel no plano XY. No caso da imagem por FtsZ em cianobactérias multicelulares, como Anabaena sp.PCC7120, manter os filamentos em posição vertical é um desafio devido ao tamanho das células e ao comprimento dos filamentos. Neste artigo, descrevemos um método que permite a imobilização vertical de filamentos de Anabaena sp., PCC 7120, usando agarose de baixo ponto de fusão e seringas, para registrar o anel Z em um mutante que expressa uma proteína de fusão FtsZ-sfGFP. Este método é uma maneira rápida e barata de registrar a dinâmica de proteínas no local de divisão usando microscopia confocal.
Introduction
A divisão celular bacteriana é o processo no qual uma célula-mãe gera duas células-filhas, na maioria dos casos pelo mecanismo conhecido como fissão binária. Um dos eventos mais precoces no processo de septação é a localização de FtsZ no meio da célula1. Essa proteína, estruturalmente homóloga à tubulina2, é conservada e amplamente distribuída na maioria das bactérias, e sua polimerização gera uma estrutura contrátil conhecida como anel Z3. Este anel serve como um andaime para outras proteínas de divisão e juntos eles formam uma maquinaria molecular chamada divisome. Vários estudos têm demonstrado que o anel Z é altamente dinâmico e que os protofilamentos FtsZ se movem por esteira 4,5,6. Para estudar o anel Z em experimentos de lapso de tempo, é aconselhável registrar o local de divisão no plano XY para melhor resolução e amostragem rápida. Para isso, é necessário desenvolver métodos de imobilização celular vertical que comumente incluam a nanofabricação de armadilhas celulares de microfuros e dispositivos microfluídicos complexos7.
Cianobactérias são microrganismos fotossintéticos classificados como gram-negativos por sua morfologia celular. Entretanto, filogeneticamente estão mais próximas de bactériasgram-positivas8. Esses organismos possuem genes de divisão celular que são comuns dentro de bactérias gram-positivas e gram-negativas, mas seu divisômio também contém elementos únicos9. PCC 7120 (doravante Anabaena sp.) é cianobactéria filamentosa com um plano de divisão e é um modelo para o estudo da divisão celular em cianobactérias multicelulares. Nessa linhagem, foi possível determinar o posicionamento da FtsZ no meio das células10. No entanto, não há estudos mostrando a dinâmica in vivo da FtsZ neste modelo. Em nosso laboratório, através de acasalamento triparental e recombinação homóloga, obtivemos um mutante totalmente segregado de Anabaena sp., que expressa a proteína FtsZ fusionada à sfGFP, que substituiu o gene ftsZ endógeno completo. Desenvolvemos um método rápido e simples de imobilização celular que favorece a orientação vertical dos filamentos de deformação mutantes para experimentos de time-lapse para visualizar a divisão de proteínas em cianobactérias filamentosas. Este método não necessita de dispositivos microfluídicos que podem ser caros e difíceis de desenvolver. Como exemplo, usamos este protocolo para visualizar o anel Z no mutante FtsZ-sfGFP por microscopia confocal.
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Protocol
1. Considerações e seleção do modelo celular
NOTA: As cianobactérias têm uma forte autofluorescência devido à presença de pigmentos fotossintéticos. Este sinal está na parte vermelha do espectro, portanto, as proteínas fluorescentes adequadas para imageamento em cianobactérias são as que estão longe da emissão vermelha. Por exemplo, GFP, YFP, Vênus, Turquesa e BFP.
- Selecione um componente divisômico presente na cepa de cianobactéria filamentosa alvo. Para os experimentos, é necessário construir um mutante cianobacteriano filamentoso que expresse o componente divisômico selecionado fundido a uma proteína fluorescente. Neste protocolo, um mutante de Anabaena sp., que expressa FstZ-sfGFP, como exemplo. Esta cepa foi obtida por acasalamento triparental com E. coli11.
- Verifique o nível de segregação do mutante que será utilizado. No exemplo, a segregação foi determinada por amplificação por PCR do gene alvo. O mutante FtsZ-sfGFP usado neste protocolo é uma cepa totalmente segregada que não possui o gene ftsZ selvagem.
2. Condições de crescimento
- Fazer um novo subcultivo do mutante usando 10 mL de cultura em fase estacionária (cultivada por aproximadamente 14 dias em luz constante, a 25°C , para Anabaena sp.) e adicionando a 90 mL de meio BG11 suplementado com antibióticos (Spectinomicina e Streptomicina 10 μl ml-1 para o mutante FtsZ-sfGFP).
- Cultivar a nova cultura celular em luz constante e na temperatura ideal até atingir a fase exponencial. O mutante FtsZ-sfGFP de Anabaena sp.
3. Preparação da amostra em matriz de agarose
- Tomar 2 mL da cultura de crescimento homogeneizada.
- Centrifugar a 2.500 x g por 10 min à temperatura ambiente.
- Enquanto isso, em um frasco de 50 mL, aquecer 30 mL de agarose de baixo ponto de fusão a 3% em meio líquido BG11. Use um micro-ondas regulado para o nível de potência média e verifique a solução a cada 15 s até dissolver completamente. Reserve para esfriar até 37 °C.
OBS: Autoclave a solução de agarose para evitar contaminação. - Feita a centrifugação, descartar 1,9 mL do sobrenadante e ressuspender as células no volume restante, pipetando pelo menos três vezes para cima e para baixo.
- Misturar as células ressuspensas com 900 μL da solução de agarose a 3%, pipetando para cima e para baixo pelo menos três vezes.
NOTA: A solução de agarose deve ser líquida, mas não muito quente para evitar danos celulares. O próximo passo deve ser realizado rapidamente e antes que a solução de agarose forme um gel como consistência =. - Aspirar cuidadosamente a matriz de agarose numa seringa de 1 ml. É importante evitar a geração de bolhas enquanto a amostra está sendo aspirada com a seringa.
NOTA: Antes desta etapa, certifique-se de que a ponta da seringa está cortada para eliminar o orifício de entrada estreito. - Deixar solidificar a mistura amostra-agarose colocando a seringa na posição horizontal à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Retire a matriz de agarose cuidadosamente usando o êmbolo e coloque-a em uma superfície limpa e plana.
- Corte a amostra solidificada em fatias, na faixa de espessura de 0,5 a 1 mm, mantendo a integridade da matriz.
NOTA: Para melhores resultados, corte a matriz de agarose usando um bisturi ou lâminas de barbear finas. - Coloque as fatias lado a lado sobre uma lamínula. O número de discos em uma lamínula dependerá de suas dimensões.
NOTA: Para microscopia de lapso de tempo, recomenda-se o uso de uma câmara celular feita para análise de microscopia (por exemplo, câmaras magnéticas Attofluor ou Chamlida). Estas câmaras permitem a aquisição da amostra evitando a desidratação. Neste exemplo, as amostras são preparadas em lamínulas arredondadas (25 mm) usando a câmara Attofluor. - Adicionar 2 ml de solução de agarose a 3% derretida sobre a amostra colocada na câmara para evitar a desidratação.
- Espere até que a solução de agarose esteja completamente solidificada para formar um gel.
4. Aquisição de imagens
- Padronizar os parâmetros para visualização da proteína fluorescente de interesse na cepa mutante em microscópio confocal. Certifique-se de que o microscópio pode detectar a autofluorescência e o marcador fluorescente selecionado.
- Visualize a amostra na conformação do campo brilhante com ampliação máxima e procure um filamento orientado verticalmente como mostrado na Figura 1.
- Encontre o local de divisão de interesse com uma varredura inicial usando o sinal de autofluorescência ao longo do plano Z.
- Use os parâmetros do marcador de proteína fluorescente para visualizar o sinal da proteína de interesse no local de divisão.
- Realizar experimentos de lapso de tempo de acordo com o modelo biológico e a proteína de interesse. Por exemplo, neste caso, experimentos de lapso de tempo de 10 s em 50 s foram realizados para registrar a dinâmica de FtsZ ao longo do anel Z em Anabaena sp.
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Representative Results
Visualização do anel Z em Anabaena sp., pelo método de imobilização vertical
Para estudar a dinâmica dos componentes do anel Z em bactérias, é necessário adquirir imagens em células orientadas verticalmente. Nesta posição, é possível visualizar o anel Z e as principais proteínas do divisômio para monitorar a dinâmica proteica por microscopia de lapso de tempo. A preparação clássica de amostras para bactérias não funciona para cianobactérias filamentosas. No caso de Anabaena sp., os filamentos são orientados em uma posição que não permite visualizar o anel Z. Além disso, não é possível manter os filamentos imobilizados para a correta visualização das proteínas de divisão celular em uma única célula por longos períodos de tempo. Portanto, para visualizar os anéis Z do mutante FtsZ-sfGFP em Anabaena sp, desenvolvemos e padronizamos um protocolo utilizando agarose LMP e incubação horizontal da amostra. Este protocolo permite a obtenção de maior proporção de filamentos orientados verticalmente, em comparação aos procedimentos previamente utilizados (Figura 1). Portanto, foi possível registrar o anel Z no plano XY em células da linhagem mutante em contato direto com a lamínula (Figura 2A).
Dinâmica dos anéis Z no mutante FtsZ-sfGFP Anabaena sp., utilizando o método de imobilização vertical
Após testar o método de imobilização vertical em microscopia confocal convencional, amostras do mutante FtsZ-sfGFP Anabaena sp preparado usando o mesmo protocolo foram visualizadas por microscopia Airyscan. Com essa técnica, observamos menor fotoclareamento nos anéis e, portanto, os experimentos podem ser realizados por períodos mais longos sem perder o sinal de fluorescência. De fato, conseguimos obter imagens por períodos de aproximadamente 16,5 min, com aquisição de imagens a cada 10 s com baixo fotoclareamento, o que nos permitiu detectar variações na intensidade da fluorescência ao longo do tempo em diferentes regiões do anel Z (Figura 2B).
Gráfico 1. Visualização de filamentos de Anabaena sp. Uma amostra de Anabaena sp foi incubada horizontalmente em LMP agarose 3% em BG11 dentro de uma seringa. A amostra foi então cortada em discos e, finalmente, colocada na câmara celular. A visualização das células foi realizada utilizando-se microscópio invertido. (A) Microscopia de campo claro representativa de uma amostra incubada na matriz de agarose sem realizar o método de imobilização vertical. Esta imagem mostra que a maioria dos filamentos são orientados horizontalmente. Barra de escala = 20 μm. (B) Microscopia representativa de campo claro mostrando uma alta proporção de filamentos orientados verticalmente de Anabaena sp., após o uso do método de imobilização vertical. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Visualização do anel Z em filamentos orientados verticalmente de Anabaena sp. Para exibir os anéis-Z no plano XY, as células da cepa sfGFP-FtsZ foram incubadas em agarose LMP 3% a 25 °C seguindo o método de imobilização vertical (I.A). A microscopia de campo brilhante mostra um filamento do mutante em posição vertical. Barra de escala =10 μm. (A.II) O sinal FtsZ-sfGFP em um anel Z do filamento mostrado em (I.A ). Esta imagem é a intensidade média de 6 imagens tiradas a cada 10 s por 1 min. Barra de escala = 2 μm (B) FtsZ-sfGFP sinal do anel Z registrado a cada 10 s por 50 s nas células do mutante FtsZ-sfGFP orientado verticalmente na matriz BG11-agarose. O tempo (segundos) é indicado no canto superior esquerdo de cada imagem. É possível observar o anel Z e um aglomerado de FtsZ-sfGFP que muda de posição ao longo do tempo (setas brancas). Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O estudo da dinâmica das proteínas divisômicas é, sem dúvida, um desafio. Particularmente, nas cianobactérias filamentosas, um dos desafios é a visualização do anel Z no plano horizontal, para o qual as células devem ser orientadas verticalmente. O método aqui descrito permite o posicionamento do anel Z no plano XY para realizar as diferentes análises. Este é o primeiro método simples para cianobactérias filamentosas que permite a visualização completa do anel Z.
Embora este protocolo seja simples e rápido, cuidados especiais devem ser tomados durante a etapa de preparação da amostra na matriz de agarose, uma vez que a agarose de baixo ponto de fusão deve estar em uma temperatura adequada para ser fluida o suficiente para ser misturada com a solução celular. Ao mesmo tempo, a solução de agarose não pode ser muito quente, uma vez que pode provocar danos celulares. Outro passo crítico a considerar é o corte dos discos, pois se não for feito com cuidado, a matriz pode colapsar e danificar a amostra.
Usando este método, a proporção de filamentos na posição vertical é maior do que com o protocolo clássico. No entanto, é necessário cortar o maior número possível de discos para garantir a análise estatística, ou seja, vários filamentos na posição vertical.
Comparado com outros métodos, onde estudos de célula única em sistemas microfluídicos podem ser realizados, nosso método é mais fácil, rápido e barato, exigindo apenas materiais e reagentes que estão facilmente disponíveis em qualquer laboratório. Por outro lado, embora os sistemas microfluídicos estejam sendo amplamente utilizados em estudos de cianobactérias multicelulares, até onde sabemos, eles não resolveram o problema do posicionamento celular na posição vertical12.
Uma limitação da técnica é que a orientação nem sempre é perfeita. Isso porque observamos filamentos inclinados na matriz de agarose, porém, com a triagem prévia utilizando sinal de autofluorescência é possível identificar este artefato. Além disso, não foi possível visualizar um evento de divisão completo, pois este protocolo permite a visualização do local de divisão em até 1 hora, enquanto o tempo de divisão de Anabaena sp. No entanto, este protocolo pode ser útil para registrar um evento de divisão completa em bactérias de crescimento rápido.
Embora nosso método tenha sido padronizado para Anabaena sp., ele pode ser aplicado a todas as cianobactérias filamentosas ou organismos filamentosos, para estudar não apenas FtsZ, mas também outras proteínas associadas ao divissoma, uma vez que elas serão orientadas no mesmo plano XY.
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Disclosures
Não há conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos às bolsas nacionais de doutorado (ANID 21211333; 21191389) pelo financiamento. Grant Fondecyt 1161232.
Este trabalho foi apoiado pelo Advanced Microscopy Facility UMA UC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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