Summary
Nous présentons ici l’extraction et la préparation de métabolites polaires et semi-polaires à partir d’un holobionte corallien, ainsi que de tissus coralliens hôtes séparés et de fractions cellulaires de Symbiodiniaceae, pour l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse.
Abstract
Les approches basées sur la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse (GC-MS) se sont avérées puissantes pour élucider la base métabolique de la symbiose cnidaire-dinoflagellé et la façon dont le corail réagit au stress (c’est-à-dire pendant le blanchissement induit par la température). Le profilage des métabolites à l’état d’équilibre de l’holobionte corallien, qui comprend l’hôte cnidaire et ses microbes associés (Symbiodiniaceae et autres protistes, bactéries, archées, champignons et virus), a été appliqué avec succès dans des conditions ambiantes et de stress pour caractériser l’état métabolique holistique du corail.
Cependant, pour répondre aux questions entourant les interactions symbiotiques, il est nécessaire d’analyser les profils de métabolites de l’hôte corallien et de ses symbiotes algales indépendamment, ce qui ne peut être réalisé que par une séparation physique et un isolement des tissus, suivis d’une extraction et d’une analyse indépendantes. Bien que l’application de la métabolomique soit relativement nouvelle dans le domaine corallien, les efforts soutenus des groupes de recherche ont abouti au développement de méthodes robustes pour analyser les métabolites dans les coraux, y compris la séparation du tissu hôte du corail et des symbiotes d’algues.
Cet article présente un guide étape par étape pour la séparation des holobiontes et l’extraction des métabolites pour l’analyse GC-MS, y compris les étapes clés de l’optimisation à prendre en compte. Nous montrons comment, une fois analysé indépendamment, le profil métabolitique combiné des deux fractions (corail et Symbiodiniaceae) est similaire au profil de l’ensemble (holobionte), mais en séparant les tissus, nous pouvons également obtenir des informations clés sur le métabolisme et les interactions entre les deux partenaires qui ne peuvent être obtenues à partir de l’ensemble seul.
Introduction
Les métabolites représentent les produits finaux des processus cellulaires, et la métabolomique - l’étude de l’ensemble des métabolites produits par un organisme ou un écosystème donné - peut fournir une mesure directe du fonctionnement de l’organisme1. Ceci est particulièrement important pour l’exploration des écosystèmes, des interactions symbiotiques et des outils de restauration, car l’objectif de la plupart des stratégies de gestion est de préserver (ou de restaurer) des fonctions de services écosystémiques spécifiques2. Les récifs coralliens sont un écosystème aquatique qui démontre la valeur potentielle de la métabolomique pour élucider les interactions symbiotiques et relier les réponses physiologiques des coraux aux impacts au niveau de la communauté et de l’écosystème3. L’application de la chromatographie en phase gazeuse à haut débit et de la spectrométrie de masse (GC-MS) est particulièrement appréciée en raison de sa capacité à analyser rapidement un large éventail de classes de métabolites simultanément avec une sélectivité et une sensibilité élevées, à fournir une identification rapide des composés lorsque des bibliothèques spectrales sont disponibles et à fournir un haut niveau de reproductibilité et de précision, avec un coût par échantillon relativement faible.
Les coraux sont des holobiontes constitués de l’animal corallien, d’endosymbiontes photosynthétiques dinoflagellés (famille : Symbiodiniaceae4) et d’un microbiome complexe 5,6. Dans l’ensemble, l’aptitude de l’holobionte est maintenue principalement par l’échange de petites molécules et d’éléments pour soutenir le fonctionnement métabolique de chaque membre 7,8,9,10. Les approches métabolomiques se sont avérées particulièrement puissantes pour élucider les bases métaboliques de la spécificité de la symbiose9,11, de la réponse au blanchiment au stress thermique 7,8,12,13, des réponses aux maladies 14, des réponses à l’exposition à la pollution 15, de la photoacclimatation 16 et de la signalisation chimique 17 chez les coraux, ainsi que pour aider à la découverte de biomarqueurs 18,19. De plus, la métabolomique peut fournir une confirmation précieuse des conclusions déduites des techniques basées sur l’ADN et l’ARN 9,20. Il existe donc un potentiel considérable pour l’utilisation de la métabolomique pour évaluer la santé des récifs et développer des outils pour la conservation des récifs3, par exemple par la détection de biomarqueurs métaboliques du stress18,19 et pour examiner le potentiel de stratégies de gestion active telles que les subventions nutritionnelles21.
La séparation des cellules hôtes et symbiotes et l’analyse de leurs profils métabolites indépendamment, plutôt qu’ensemble comme l’holobionte, peuvent fournir plus d’informations sur les interactions des partenaires, les statuts physiologiques et métaboliques indépendants et les mécanismes moléculaires potentiels d’adaptation 11,12,22,23,24. Sans séparer le corail et les Symbiodiniaceae, il est presque impossible d’élucider la contribution et le métabolisme du corail et/ou des Symbiodiniaceae indépendamment, sauf avec la reconstruction complexe du génome et la modélisation métabolique25, mais cela n’a pas encore été appliqué à la symbiose corail-dinoflagellés. De plus, tenter d’extraire des informations sur le métabolisme individuel de l’hôte ou du symbiote algal à partir du profil métabolite de l’holobionte peut conduire à une mauvaise interprétation.
Par exemple, jusqu’à récemment, on pensait que la présence d’acides gras polyinsaturés C18 :3n-6, C18 :4n-3 et C16 dans des extraits de tissus de coraux et d’holobiontes était dérivée du symbiote algal, car on supposait que les coraux ne possédaient pas les ωx désaturases essentielles à la production d’acides gras oméga-3 (ω3) ; cependant, des preuves génomiques récentes suggèrent que plusieurs cnidaires ont la capacité de produire des AGPI ω3 de novo et de biosynthétiser davantage les AGPI26 à longue chaîne ω3. La combinaison de la GC-MS et du marquage isotopique stable (par exemple, 13 C-bicarbonate, NaH 13CO 3) peut être utilisée pour suivre le devenir du carbone fixé photosynthétiquement à travers les réseaux métaboliques holobiontes coralliens dans des conditions de contrôle et en réponse à des facteurs de stress externes27,28. Cependant, une étape critique dans le suivi du devenir du 13C est la séparation du tissu corallien des cellules algales - ce n’est qu’à ce moment-là que la présence d’un composé marqué au 13C dans la fraction de l’hôte corallien peut être attribuée sans équivoque comme un métabolite dérivé de Symbiodiniaceae transloqué au corail ou un produit en aval d’un composé marqué transloqué. Cette technique a démontré sa puissance en remettant en question l’hypothèse de longue date selon laquelle le glycérol est la principale forme dans laquelle la photosynthèse est transloquée du symbiote à l’hôte29, ainsi qu’en élucidant comment le flux nutritionnel inter-partenaires change pendant le blanchiment27,28 et en réponse à des espèces de Symbiodiniaceae incompatibles11.
Bien que la décision de séparer les tissus soit principalement motivée par la question de recherche, il est important de tenir compte de l’aspect pratique, de la fiabilité et des impacts métaboliques potentiels de cette approche. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées et démontrées pour l’extraction des métabolites de l’holobionte, ainsi que des fractions séparées de l’hôte et du symbiote. Nous comparons les profils de métabolites de l’hôte et du symbiote indépendamment et comment ces profils se comparent au profil de métabolite de l’holobionte.
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Protocol
NOTE : Le plan expérimental, le prélèvement et l’entreposage des échantillons ont été décrits en détail ailleurs 2,30,31. L’autorisation de prélèvement de coraux sauvages doit être obtenue avant la collecte et l’expérimentation. Les échantillons ici ont été prélevés sur des colonies de Montipora mollis (forme de couleur verte) importées de Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), prélevées à l’origine sur un récif au large des îles Abrohlos (Australie-Occidentale ; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) à une profondeur de 1 m en vertu du permis d’aquaculture AQ1643. Avant l’échantillonnage, les colonies ont été maintenues dans un aquarium de 800 L à 35 PSU, sous une lumière bleue et blanche à 150 μmol photons·m−2·s−1, et à 25 °C ± 0,5 °C pendant 3 mois. Les fragments de corail (~5 cm2, N = 6) ont été congelés dans de l’azote liquide et stockés à −80 °C jusqu’à leur traitement.
1. Préparation des solutions et des équipements d’extraction
- Au moins 1 jour avant l’enlèvement des tissus coralliens, préparez les solutions d’extraction et l’équipement.
- Prérefroidir de l’eau ultrapure dans de la verrerie propre et sans détergent à 4 °C.
- Mélanger du méthanol de qualité LC à 100 % avec une concentration finale de 10 μg·mL−1 d’étalon interne approprié (p. ex., 13C6 sorbitol).
- Créez une solution d’extraction à 50 % de méthanol en utilisant la moitié de méthanol de qualité LC à 100 % et l’autre moitié d’eau ultrapure. Conservez les deux solutions de méthanol à −20 °C.
REMARQUE : Pour aider à prévenir la dégradation des métabolites, il est recommandé d’effectuer les étapes de traitement des échantillons par lots de cinq fragments de corail à la fois, avec un blanc biologique supplémentaire (eau seulement) (total des échantillons N = 6). Une fois que chaque échantillon de corail a été séparé en deux fractions (tissu corallien hôte, ci-après « Hôte », et cellules de microalgues, désormais « Symbiote »), le nombre total d’échantillons dans un lot de traitement sera de 12.
2. Trempe du métabolisme des coraux
NOTE : Le plan expérimental, le prélèvement et l’entreposage des échantillons ont été décrits en détail ailleurs 2,30,31. Cependant, il convient de noter que le temps nécessaire pour éteindre le métabolisme (c’est-à-dire le temps entre la collecte et la conservation des échantillons de corail) est essentiel pour capturer la réponse initiale30. Conserver l’échantillon le plus rapidement possible après le prélèvement afin d’éviter toute modification de la composition des métabolites due à la dégradation de l’échantillon ou à des réponses physiologiques non ciblées32.
- Placez le fragment de corail dans un sac de prélèvement d’échantillon stérile et égouttez autant que possible l’excès d’eau de mer. Immergez l’échantillon dans de l’azote liquide pendant au moins 30 s. Déplacer les échantillons dès que possible dans un congélateur à −80 °C pour les stocker.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés à −80 °C dans des contenants à lumière bloquée jusqu’au traitement, en évitant les cycles de gel-décongélation.
3. Retrait du tissu corallien du squelette
REMARQUE : Les échantillons doivent être conservés sur de la glace (4 °C) en tout temps pour s’assurer qu’ils sont simultanément sous forme liquide tout en empêchant le métabolisme en cours.
- Placez un sac de prélèvement d’échantillon propre et stérile sur de la glace afin que le sac soit stable et ouvert sur la glace dans un puits peu profond, mais qu’il ne soit pas immergé dans la glace. Ajouter 10 mL d’eau froide (4 °C) ultrapure dans le sac.
REMARQUE : Cela aidera à éviter le gel-dégel répété du fragment de corail en raison de l’air froid sous pression et de la glace environnante. - Prélever un fragment de corail à l’aide d’une pince à épiler stérilisée et rincer à l’eau froide (4 °C) ultrapure à l’aide d’une pipette Pasteur stérile jusqu’à ce qu’il ne reste plus de résidus d’eau de mer. Plongez le fragment de corail rincé dans le sac contenant les 10 mL d’eau ultra-pure.
REMARQUE : Ce rinçage est essentiel pour éliminer les sels résiduels qui interféreraient avec l’analyse en aval. Évitez tout contact des mains avec l’eau ou le fragment de corail à travers le sac pour maintenir l’échantillon à 4 °C. - Collez une pointe de pipette stérile de 1 mL sur l’extrémité d’un pistolet à air comprimé avec du ruban isolant, en coupant l’extrémité de l’embout de ~5 mm (Figure 1A).
- Dirigez le pistolet à air comprimé sur le fragment de corail avec le sac à moitié fermé et le flux d’air à faible et moyen pour retirer doucement le tissu en encourageant un mouvement circulaire de l’eau sur le fragment de corail.
- Après ~3 min, ou lorsque tous les tissus semblent avoir été retirés du squelette, éteignez l’air et retirez l’aérographe. Fermez complètement le sac.
- Pressez tout le tissu corallien retiré dans un coin inférieur du sac. Coupez le coin opposé et versez délicatement le contenu du sac dans un tube de 15 ml sur de la glace.
4. Homogénéisation facultative
REMARQUE : Certaines espèces de coraux sont plus visqueuses que d’autres, ce qui signifie que l’aérographe éliminera les tissus en touffes plutôt que dans une boue. Si des amas de tissu sont visibles dans l’homogénat aérographe, une étape d’homogénéisation à 4 °C peut être ajoutée pour tous les échantillons.
- Nettoyez deux fois un homogénéisateur mécanique en dents de scie avec 4 °C de méthanol à 70 % et enfin avec de l’eau ultrapure à 4 °C.
- Homogénéiser l’échantillon de corail dans un tube de 15 ml pendant ~1 min jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement homogénéisé et qu’aucun amas ne soit visible.
- Nettoyez l’homogénéisateur comme à l’étape 4.1 entre chaque échantillon. Maintenez un temps d’homogénéisation cohérent entre les échantillons.
5. Prélèvement d’échantillons pour normalisation
- Prélever une aliquote de 1 000 μL dans le tissu homogénéisé pour le comptage cellulaire des Symbiodiniaceae, l’analyse de la teneur en protéines du tissu hôte du corail et l’estimation de la chlorophylle a . Conserver à −20 °C jusqu’au moment de l’analyse (rubrique 10).
6. Séparation facultative des tissus de l’hôte corallien-Symbiodiniaceae
- Centrifuger l’homogénat de corail à 2 500 × g pendant 5 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée.
REMARQUE : Cette vitesse est optimale pour séparer les cellules Symbiodiniaceae plus lourdes, tout en gardant leurs parois cellulaires intactes, du tissu hôte, qui est en suspension dans le surnageant. - Retirez le surnageant contenant le matériau hôte et placez-le dans un nouveau tube de 15 ml.
REMARQUE : Les lipides du tissu hôte forment généralement une étroite couche rose/blanche au-dessus des cellules symbiotiques. Cette couche peut être prélevée avec le surnageant de l’hôte soluble par pipetage (figure 1B). - Agitez vigoureusement l’hôte pendant exactement 1 min. Conservez l’échantillon de pastilles d’algues et l’échantillon de surnageant hôte sur de la glace.
- Ajouter 2 mL d’eau ultrapure à 4 °C à la pastille d’algue. Agitez vigoureusement pendant exactement 2 minutes pour remettre la pastille en suspension.
REMARQUE : Si des fragments individuels de 1 cm n’ont pas été prélevés dans la colonie de coraux pour le génotypage des Symbiodiniaceae, une aliquote de 200 μL de la suspension cellulaire des Symbiodiniaceae peut être prélevée ici, conservée dans la solution tampon d’ADN préférée et stockée comme décrit dans Thurber et al.30 pour le génotypage des Symbiodiniaceae (par exemple, selon González-Pech et al.12). - Répétez les étapes 6.1 à 6.4 une fois de plus.
REMARQUE : La séparation fiable de l’hôte et du symbiote dépend de la biomasse et de l’espèce de corail, car certaines espèces peuvent être plus visqueuses que d’autres. Un minimum de trois étapes de lavage est recommandé, mais cela peut être augmenté en fonction du succès de la séparation. Répétez les étapes de lavage 4.7 à 4.9 jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de cellules de Symbiodiniaceae dans la partie inférieure de la fraction hôte et jusqu’à ce que la fraction de Symbiodiniaceae soit visiblement exempte de matière hôte (p. ex., pas de couche blanche sur le dessus) (Figure 1). - Retirez le surnageant contenant le matériau hôte et placez-le dans un nouveau tube de 15 ml.
- Conservez la pastille de symbiote dans le tube de 15 mL.
7. Séchage de l’échantillon
- Congeler soit l’homogénat d’holobionte, soit les fractions de l’hôte séparé et des Symbiodiniaceae, à −80 °C pendant ~120 min. Lyophiliser les échantillons pendant la nuit avec un vide de 0,01 mbar à −85 °C.
REMARQUE : Pour éviter la perte d’échantillon lors de la lyophilisation, il est recommandé d’utiliser un couvercle découpé dans un autre tube stérile, ou un parafilm stérile, avec un trou de ~2 mm percé soigneusement à l’aide d’une aiguille stérile de 25 G. - Lorsqu’il est sec, à l’aide d’une balance de laboratoire, peser l’un des éléments suivants : 1) 25 mg d’holobionte ; 2) 15 mg de la fraction symbiote ; ou 3) 30 mg du tissu hôte de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugation séparés de 2 mL sans plastifiant.
NOTE : Étape critique : L’optimisation de la biomasse pour l’extraction est essentielle pour s’assurer que la GC-MS n’est pas surchargée tout en assurant un signal suffisant. Le matériau du corail séché est très statique. Pour éviter la perte d’échantillons, utilisez des dispositifs antistatiques pour éliminer les charges électrostatiques des échantillons et des récipients de pesée. Une alternative simple et économique consiste à placer une feuille de séchage sous le tube d’échantillonnage. Le granulé de symbiote séché peut être coupé au poids souhaité à l’aide d’une lame stérile.
8. Extractions intracellulaires de métabolites
- Extraction de métabolites intracellulaires à partir d’holobionte lyophilisé :
- Ajouter 400 μL de méthanol à froid à 100 % (−20 °C) avec étalon(s) interne(s) (IS ; 13C6 sorbitol et/ou 13C5-15 N valine, à 10μM) dans chaque tube.
- Ajouter un petit nombre de billes de verre lavées à l’acide de 710 à 1 180 μm (~ 10 mg) à chaque échantillon. Placer dans un broyeur à billes à 50 Hz pendant 3 min dans un insert de broyeur à billes pré-refroidi (−20 °C).
- Ajouter 600 μL supplémentaires de méthanol froid à 100 % (−20 °C) avec IS (13 C6 sorbitol et/ou 13C 5-15 N valine, à 10μM) dans chaque tube.
- Vortex pour mélanger pendant 1 min. Placer sur un shaker à rôtissoire à 4 °C pendant 30 min.
- Extraction de métabolites intracellulaires à partir de cellules Symbiodiniaceae lyophilisées séparées :
- Ajouter 200 μL de méthanol froid à 100 % (−20 °C) avec des IS (13 C6 sorbitol et/ou 13C 5-15 N valine, à 10μM) au matériel séché de Symbiodiniaceae.
- Ajouter un petit nombre de billes de verre lavées à l’acide de 710 à 1 180 μm (~10 mg). Placer dans un broyeur à billes à 50 Hz pendant 3 min dans un insert de broyeur à billes pré-refroidi (−20 °C).
- Ajouter 800 μL supplémentaires de méthanol à 100 % froid (−20 °C) avec des IS, et vortex pendant 30 s.
- Extraction de métabolites intracellulaires à partir de tissus hôtes lyophilisés séparés :
- Ajouter 1 mL de méthanol de qualité LC à 100 % froid (−20 °C) contenant des IS (13 C6 sorbitol et/ou 13C 5-15 N valine, à 10μM) au matériau hôte séché.
- Vortex pour mélanger pendant 20 s. Placer dans un support de tube flottant dans un bain de sonication réglé à 4 °C pendant 30 min.
9. Purification de l’extrait de métabolite
- Centrifuger les échantillons (holobionte/hôte/symbiote) à 3 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
- Transférez tout le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 2 mL, en prenant soin de ne pas perturber la pastille de débris cellulaires.
REMARQUE : Ce sont les extraits semi-polaires. Ceux-ci peuvent être conservés temporairement sur la glace, mais stockés à long terme à −80 °C dans l’obscurité. - Ajouter 1 000 μL de méthanol froid (−20 °C) à 50 % aux débris cellulaires restants. Agiter vigoureusement pendant 1 min pour remettre en suspension.
- Centrifuger les échantillons à 3 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
- Recueillir et mettre en commun le surnageant (extraits polaires) avec les extraits semi-polaires du même échantillon.
REMARQUE : Les débris cellulaires peuvent être stockés à −80 °C et utilisés pour la normalisation de la teneur en protéines (section 11). - Centrifuger les extraits regroupés à 16 100 g pendant 15 min pour éliminer tous les précipités, puis déplacer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation sans plastifiant (2 ml).
REMARQUE : Les extraits d’échantillons peuvent être conservés à −80 °C dans l’obscurité. - Au moment de l’analyse, aliquote 50 μL de chaque extrait dans un insert en verre. Concentrez pendant 30 min à 30 °C à l’aide d’un concentrateur sous vide. Répétez l’opération quatre fois de plus (pour 250 μL d’extrait séché total).
REMARQUE : Les échantillons séchés peuvent être conservés à température ambiante dans des conditions de dessiccation jusqu’à l’analyse.
10. Dérivation des métabolites
NOTE : Un procédé de dérivation en ligne en deux étapes est utilisé pour la méthoxymation et la triméthylsilylation des métabolites polaires.
- Ajouter 25 μL de chlorhydrate de méthoxyamine (30 mg/mL dans la pyridine) à chaque échantillon.
- Agiter à 37 °C sur un agitateur orbital réglé à 750 tr/min pendant 2 h.
- Ajouter 25 μL de N,O-bis (triméthylsilyl)trifluoroacétamide + triméthylchlorosilane à chaque échantillon.
- Agiter à nouveau à 37 °C et 750 tr/min pendant 1 h.
- Laisser les échantillons s’équilibrer à température ambiante pendant 1 h avant d’injecter 1 μL dans un rapport de fractionnement de 1 :10 sur le GC.
11. Analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse
REMARQUE : Le spectromètre de masse doit être réglé selon les recommandations du fabricant à l’aide de tris-(perfluorobutyl)-amine (CF43).
- Utilisez de l’hélium de très haute pureté comme gaz vecteur à un débit de colonne constant de 1 mL/min.
- Utilisez une colonne DB-5 de 30 m avec une épaisseur de film de 1 μm et un diamètre intérieur de 0,25 mm.
- Programme du four GC
- Réglez la température d’entrée à 280 °C.
- Commencer à l’injection avec une température de four de 100 °C et maintenir pendant 4 min.
- Augmentez la température de 10 °C/min à 320 °C, puis maintenez pendant 11 min.
- Paramètres du spectromètre de masse
- Réglez la ligne de transfert MS sur 280 °C et réglez la source d’ions sur 200 °C.
- Utilisez l’argon comme gaz de cellule de collision pour générer l’ion produit de surveillance des réactions multiples (MRM).
- Réalisez la détection des métabolites par rapport à une bibliothèque MRM segmentée dans le temps contenant des cibles MRM.
12. Comptage des cellules Symbiodiniaceae, analyse de la teneur en protéines des tissus de l’hôte corallien et estimation de la chlorophylle a
- Numération cellulaire des Symbiodiniaceae :
- Prenez une aliquote de l’homogénat de tissu corallien.
- Centrifuger les échantillons à 2 000 × g pour granuler les algues.
- Retirez le surnageant de ~200 μL de la pastille d’algues et placez-le dans un nouveau tube de microcentrifugation.
REMARQUE : Il s’agira de l’échantillon de protéines qui sera utilisé pour normaliser les données. Conservez-le à −20 °C avant de l’analyser, si nécessaire. - Remettre en suspension la pastille d’algues dans 1 mL d’eau de mer filtrée en pipetant doucement de haut en bas. Si nécessaire, diluez la suspension d’algues pour faciliter le comptage cellulaire.
- Effectuer une numération cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre sous un microscope optique en ajoutant 10 μL dans l’une des chambres. Effectuer 8 à 10 comptages par échantillon.
NOTA : D’autres méthodes de dénombrement des cellules algales peuvent également être appliquées lorsqu’elles sont disponibles (p. ex., cytométrie en flux, microscopie confocale à haut débit). - Calculer la concentration des cellules symbiotes (mL−1), en tenant compte des facteurs de dilution utilisés.
- Dosage de la teneur en protéines
- Quantifier la teneur en protéines de l’échantillon (par exemple, via le test colorimétrique de Bradford, tel que décrit initialement par Bradford et al.33, ou le test de Lowry34,35, dont le protocole a été décrit pour les cnidaires ailleurs 36).
- Extraction de la chlorophylle a
- Utilisez une pastille cellulaire de ~200 000 cellules, congelée ou fraîche.
- Transférer chaque pastille d’algues dans 2 mL de diméthylformamide (DMF) dans un flacon à scintillation en verre et incuber à l’obscurité à 4 °C pendant 48 h.
REMARQUE : Le DMF est toxique et cancérigène, de sorte que la préparation de l’échantillon doit être effectuée sous une hotte aussi sombre que possible et sur de la glace. S’il y a < 200 000 cellules, utilisez moins de DMF. - Centrifuger pendant 3 min à 16 000 × g.
- Transférez 200 ml dans une plaque à puits UV-96 pour les mesures photométriques. Exécutez chaque échantillon en trois exemplaires avec DMF comme blanc.
- Mesurez l’absorbance aux longueurs d’onde (E) 663,8 nm, 646 nm et 750 nm. Soustrayez l’absorbance à 750 nm de l’absorbance aux deux autres longueurs d’onde.
REMARQUE : La mesure à 750 nm corrige toute dispersion ou turbidité dans l’échantillon. - Calculer la concentration en chlorophylle a (μg/mL) à l’aide de l’équation (1) :
Concentration de Chl a (μg/mL) = (12,00 × E 663,8) - (3,11 × E646,8) (1)
13. Quantification de la biomasse cellulaire après extraction de métabolites pour normalisation
NOTA : Il existe deux options pour la quantification de la biomasse cellulaire décrites ci-dessous : la quantification des protéines liées à la biomasse à l’aide d’une méthode colorimétrique Bradford modifiée et la mesure du poids sec des débris cellulaires. L’une ou l’autre méthode est appropriée, car les deux offrent une quantification précise de la biomasse cellulaire.
- Teneur en protéines des débris cellulaires
- Remettre en suspension les débris cellulaires congelés avec 1 mL de NaOH 0,2 M et incuber les échantillons à 98 °C pendant 20 min.
- Refroidir les échantillons sur de la glace pendant ~10 min et centrifuger à 3 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Quantifier la teneur en protéines de l’échantillon (p. ex., à l’aide du test colorimétrique de Bradford, tel que décrit initialement par Bradford et al.33 et modifié par Smart et al.37).
- Mesure du poids sec des débris cellulaires
- Remettre en suspension les débris cellulaires issus de l’extraction des métabolites intracellulaires dans de l’eau doublement distillée (~10 mL).
- Filtrer la solution sous vide à l’aide d’un filtre à membrane prépesé (pores de 0,22 μm, 47 mm).
- Lavez deux fois les tubes contenant de la biomasse avec de l’eau ultrapure pour assurer le transfert complet de la biomasse vers le filtre à membrane.
- Retirez le filtre à membrane contenant la biomasse et séchez-le à l’aide d’un four à micro-ondes (faible puissance ; ~250 W pendant 20 min).
- Conservez le papier filtre dans un dessiccateur pendant la nuit. Enregistrez le poids sec du papier filtre et calculez le poids sec de la biomasse en soustrayant le poids du filtre à membrane sèche (à l’aide d’un filtre à membrane propre et sec séché à côté du filtre à échantillon) du poids total.
14. Analyse des données
- Analysez les cibles de métabolites à l’aide de bases de données de métabolites où chaque cible est composée d’un quantificateur et d’un qualificateur MRM.
- Inspectez visuellement les cibles de métabolites détectées et intégrez-les manuellement au besoin.
- Utilisez une aire de pic de métabolites pour calculer l’abondance relative de chaque échantillon pour chaque groupe. Les valeurs sont corrigées à blanc et normalisées pour échantillonner la zone de pic standard interne, puis pour échantillonner la teneur en protéines des débris cellulaires conformément à Smart et al.37.
- Éliminer les métabolites dont l’écart-type relatif est supérieur à 35 % dans tous les groupes de traitement (N = 23 métabolites).
- Transformez les données (par exemple, la racine cubique) et centrez-les moyennement ; confirment une distribution normale et une homogénéité de la variance.
- Effectuer l’analyse des données (ANOVA et construction de cartes thermiques, p. ex., à l’aide de https://www.metaboanalyst.ca)38. Regroupez les échantillons pour examiner la variabilité au sein du traitement à l’aide des packages « cluster », « factoextra » et « klustR ». Calculez la statistique d’écart (une méthode pour déterminer le nombre optimal d’agrégats39) à l’aide de la fonction « clusGap » dans R et tracez à l’aide du package R « tidyverse ». Effectuer des PERMANOVAs pour examiner l’importance de la séparation entre les profils de métabolites du traitement (p. ex., dans Primer).
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Representative Results
Toutes les données produites au cours de ces travaux sont disponibles dans les informations complémentaires.
Séparation hôte-symbiote
Figure 1 : Mise en place et validation de la séparation des tissus de l’hôte corallien et des cellules de Symbiodiniaceae. (A) La configuration du pistolet à air comprimé pour l’élimination du tissu corallien du squelette corallien. Un embout de pipette est fixé au pistolet à air comprimé avec du ruban isolant, et une petite section (~5 mm) est coupée de l’embout pour permettre à plus d’air de s’échapper sans déloger l’embout. (B) Exemples d’holobiontes et de tissus hôtes séparés (surnageant) et de cellules de Symbiodiniaceae (pastilles). La valeur représente le nombre d’étapes de centrifugation. La flèche pointe vers l’étroite couche lipidique de l’hôte au-dessus de la pastille de symbiote qui peut être collectée et combinée avec la fraction de l’hôte. (C-E) Images en fond clair (en haut) et en microscopie par autofluorescence de la chlorophylle (en bas) d’une aliquote de l’holobionte (C) avec le tissu hôte et les cellules symbiotiques, (D) la fraction hôte sans cellules symbiotes, telle que vérifiée par l’absence d’autofluorescence de la chlorophylle, et (E) cellules symbiotes intactes, démontrant l’élimination du tissu hôte. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La visualisation microscopique n’a montré aucune cellule de Symbiodiniaceae dans les échantillons de tissus de l’hôte après les trois étapes de lavage (Figure 1D). De même, il y avait peu de tissu hôte présent dans les fractions symbiotes (Figure 1E). Cependant, l’homogénat d’holobionte (Figure 1C) a montré que les Symbiodiniaceae intracellulaires n’ont peut-être pas été suffisamment libérées de leurs symbiosomes par simple aérographe et, par conséquent, pas suffisamment lysées lors de l’homogénéisation mécanique (section 4 du protocole) ou de l’extraction par solvant (section 8 du protocole) par rapport à la séparation centrifuge (Figure 1E). Cette limitation pourrait expliquer une partie de la grande variation au sein d’un même groupe entre les échantillons d’holobiontes et des observations spécifiques dans les profils d’holobiontes. Par exemple, deux métabolites (l’acide glycolique et le 1-hexadécanol) étaient significativement plus abondants dans l’holobionte que dans le symbiote, mais pas dans l’hôte que dans le symbiote ; Cela peut être le résultat de la grande variation au sein d’un même groupe dans l’abondance relative de ces métabolites dans les profils d’holobiontes. En particulier, l’échantillon d’holobionte 3 présentait des concentrations relativement plus élevées d’acide dodécanoïque, d’acide glycolique et de 1-hexdécanol que n’importe lequel des échantillons de symbiotes ou d’hôtes pris individuellement. Comme les données sur la surface du pic des métabolites sont normalisées en fonction de la teneur en protéines de l’échantillon, si les cellules symbiotes n’ont pas été suffisamment nettoyées du tissu hôte, la teneur en protéines de l’holobionte peut avoir été sous-estimée, influençant ainsi la normalisation de la biomasse et conduisant au calcul d’une abondance de métabolites plus élevée par rapport à la biomasse dans cet échantillon. Cela met en évidence le potentiel d’une variation accrue de la métabolomique des holobiontes.
Analyse du profil des métabolites
Le choix du mode du spectromètre de masse dépend de l’analyse effectuée. Pour le profilage des métabolites à l’état d’équilibre, une méthodologie ciblée complète utilisant un QqQ-MS en mode MRM permet d’améliorer la détection et l’identification des métabolites grâce à l’élimination du bruit de fond qui peut être généré par des concentrations élevées de sels biologiques. Pour les approches de marquage isotopique stable, un spectromètre de masse (c’est-à-dire un quadripôle simple, un quadrupôle triple [QqQ], un temps de vol quadripolaire [QTOF]) fonctionnant en mode balayage permet de détecter des isotopes de masse qui indiquent des modèles d’enrichissement isotopique stables.
L’analyse GC-MS ciblée a été réalisée à l’aide de la base de données Shimadzu Smart Metabolite Database (v3, qui couvre environ 350 métabolites endogènes et plusieurs étalons internes stables marqués isotopiquement) et du logiciel Shimadzu LabSolutions Insight. Dans l’ensemble des traitements, 107 métabolites annotés ont été identifiés, y compris une série d’acides aminés, d’acides organiques, de glucides, d’acides gras et de stérols (tableau supplémentaire S1). Les paires d’ions qualitatives et quantitatives sont présentées dans le tableau supplémentaire S2. Le regroupement de Kmeans a permis d’identifier trois groupes distincts d’échantillons (vérifiés par un test statistique d’écart), tous les échantillons étant regroupés séparément et distinctement ; les symbiotes se trouvaient dans le groupe 1, l’hôte dans le groupe 2 et les échantillons d’holobiontes dans le groupe 3 (Figure 2).
Figure 2 : Analyse des profils de métabolites par Kmeans. (A) Les profils de métabolites de l’échantillon ont été regroupés en fonction de la distance euclidienne par le nombre optimal d’amas (N = 3), ce qui a été vérifié par un calcul statistique d’écart. (B) Visualisation des coordonnées parallèles de l’abondance relative moyenne des métabolites (ligne, colorée en fonction de l’agrégat) et de l’intervalle de confiance (ombrage, coloré en fonction de l’agrégat) pour chaque groupe (rouge = groupe 1, vert = groupe 2, bleu = groupe 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Comparaison du profil des métabolites de l’hôte et du symbiote
Les profils de l’hôte et du symbiote étaient significativement distincts l’un de l’autre (PERMANOVA, t = 16,909, p < 0,001 ; Tableau supplémentaire S3), avec 100 métabolites individuels significativement différents entre les fractions de l’hôte et du symbiote (ANOVA, FDR < 0,05 ; Figure 3 et tableau supplémentaire S1). Parmi ceux-ci, 13 métabolites étaient significativement plus abondants dans le symbiote que les extraits de l’hôte, y compris l’acide eicosanoïde docosahexaénoïque (C22 :6[ω-6] ; DHA), l’acide eicosapentaénoïque (C20 :5[ω-6] ; EPA) et l’acide arachidonique (C20 :4[ω-6] ; ARA) (ANOVA, FDR < 0,05 ; Figure 3 et tableau supplémentaire S1). Au total, 87 métabolites étaient moins abondants dans le symbiote que dans les extraits de l’hôte (ANOVA, FDR < 0,05 ; Figure 3 et tableau supplémentaire S1).
Figure 3 : Visualisation de la carte thermique des abondances relatives des métabolites avec les résultats de l’analyse post-hoc des comparaisons de groupes. Les échantillons d’hôtes, de symbiotes et d’holobiontes (N = 5 par groupe) ont été regroupés hiérarchiquement via la liaison de Ward, et les métabolites ont été regroupés en fonction de la mesure de distance euclidienne. Les carrés colorés indiquent des différences significatives dans les comparaisons de groupes détectées par ANOVA avec le HSD de Tukey post hoc (tableau supplémentaire S1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Profils de métabolites d’holobiontes comparés aux profils séparés de l’hôte et du symbiote
Les profils de métabolites des holobiontes ont démontré une grande variabilité au sein du groupe, corroborée par la grande séparation des échantillons dans le groupe d’holobiontes dans l’analyse Kmeans ; plus précisément, l’échantillon 3 et l’échantillon 4 ont été séparés le long de la dimension 2 de l’échantillon 1, de l’échantillon 2 et de l’échantillon 5 (figure 2A). Les échantillons d’holobiontes étaient intermédiaires entre les fractions séparées de l’hôte et du symbiote (Figure 2A). Alors que les distributions de l’amas Kmeans (Figure 2A), les coordonnées parallèles (Figure 2B) et la visualisation de l’abondance relative des métabolites par carte thermique (Figure 3) indiquaient que le profil de l’holobionte correspondait plus étroitement au profil de la fraction de l’hôte, le profil de l’holobionte différait significativement de celui de l’hôte (PERMANOVA, t = 3,47, p < 0,001 ; Tableau supplémentaire S3) et les profils de symbiotes (PERMANOVA, t = 11,29, p < 0,001 ; Tableau supplémentaire S3). Au niveau des métabolites individuels, 66 et 82 métabolites de l’holobionte étaient significativement différents des profils de l’hôte et du symbiote, respectivement (ANOVA, FDR < 0,05, tableau supplémentaire S1). Parmi ceux-ci, 54 (81,8 %) des 66 métabolites significatifs avaient une abondance relative significativement plus élevée dans l’hôte que la fraction holobionte, et 78 (95 %) avaient une abondance relative significativement plus élevée dans l’holobionte que dans la fraction symbionte ; quatre étaient plus abondants dans les fractions symbiotes, y compris le DHA, le glycérol-3-phosphate, le phosphate d’inositol et l’acide phosphorique (Figure 3). Huit métabolites (dont deux acides gras [acides linoléique (C18 :1) et myristique (C14 :0)], cinq acides dicarboxyliques et l’acide aminé guanine) présentaient une différence significative en abondance entre l’hôte et le symbiote, mais pas par rapport à la fraction holobionte (Figure 3).
Tableau supplémentaire S1 : L’abondance relative de chaque métabolite identifié à l’aide de l’analyse GC-MS dans l’holobionte et l’hôte et le symbiote séparés. Les valeurs sont moyennes ± l’erreur-type, et les résultats de l’ANOVA fournis, y compris l’analyse post-hoc, sont indiqués par les cellules colorées (colonnes K, L et M). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S2 : Paires d’ions qualitatifs et quantitatifs pour les métabolites identifiés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau complémentaire S3 : Résultats de l’étude PERMANOVA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La séparation de l’hôte et du symbiote est facilement et rapidement réalisable par simple centrifugation, et les résultats montrent ici que la séparation des fractions peut fournir des informations précieuses indiquant des contributions spécifiques des membres de l’holobionte, ce qui peut contribuer à l’analyse fonctionnelle de la santé des coraux. Chez les coraux adultes, la synthèse des lipides est principalement effectuée par le symbiote algalerésident 40, qui fournit des lipides (par exemple, le triacylglycérol et les phospholipides)41 et des acides gras qui peuvent favoriser la récupération après le stress 11,42. Sur les 13 métabolites qui étaient plus abondants dans les profils de symbiotes par rapport à l’hôte dans ce travail, 9 étaient des acides gras, y compris les eicosanoïdes biologiquement pertinents DHA (C22 :6[ω-6]), EPA (C20 :5[ω-6]) et ARA (C20 :4[ω-6]), qui sont impliqués dans la signalisation du stress inter-règne dans la symbiose corail-Symbiodiniaceae 9,10. Le phosphate d’inositol joue un rôle crucial dans diverses fonctions cellulaires, notamment la croissance cellulaire, l’apoptose, l’endocytose et la différenciation cellulaire. On a souvent constaté que les abondances relatives des isoformes et des dérivés de l’inositol changeaient au cours du dysfonctionnement de la symbiose 7,11,27,28, bien que le rôle de ces isoformes et de leurs dérivés dans la symbiose corall-Symbiodiniaceae reste incertain. Ainsi, la nette différence d’abondance relative entre les profils d’hôtes et de symbiotes contribue à cette connaissance.
De nombreuses études ont utilisé les profils de métabolites holobiontes pour étudier les interactions métaboliques et les performances des coraux dans des conditions ambiantes et de stress 13,43,44,45. Ici, nous montrons que l’analyse de l’homogénat d’holobionte peut entraîner une grande variabilité au sein du traitement, et que les profils qui en résultent peuvent masquer les modèles d’abondance spécifiques à l’hôte et/ou au symbiote et les contributions métaboliques au métabolome global de l’holobionte. Par exemple, sur les 13 métabolites qui étaient significativement plus abondants dans le symbionte par rapport à la fraction hôte, seuls 4 étaient significativement plus abondants dans le symbiote par rapport à l’holobionte. Ceux-ci comprenaient le DHA et le phosphate d’inositol potentiellement biologiquement pertinents 7,9,10,11,27,28 ; cependant, les différences distinctes observées dans les eicosanoïdes EPA et ARA signalant le stress entre l’hôte et le symbiote n’étaient pas significatives dans les échantillons d’holobiontes par rapport aux échantillons de symbiotes. Ces métabolites sont de plus en plus reconnus comme des métabolites importants dans le langage moléculaire de la symbiose et comme indicateurs des réponses au stress10, mais l’examen des profils d’holobiontes à lui seul ne révélerait pas les changements distincts dans les rapports d’abondance relative de ces métabolites chez des membres spécifiques de l’holobionte. Ainsi, l’analyse de l’holobionte peut masquer des différences qui sont autrement apparentes lorsque l’hôte et le symbiote sont analysés séparément, et ces différences pourraient ne pas être détectées comme significatives dans les études qui comparent des traitements abiotiques ou biotiques utilisant uniquement des profils d’holobiontes. Cela pourrait rendre difficile l’inférence de contributions ou de fonctions spécifiques des partenaires 7,8,9,11,12,22,28, en particulier lorsque l’on tente de répondre à des questions biologiques pour lesquelles des interactions symbiotiques sous-tendent le phénotype holobionte observé 46,47.
Une autre méthode consisterait à séparer les tissus de l’hôte et les cellules symbiotes, à prélever une aliquote de l’homogénat ou un extrait de chaque fraction à recombiner avant l’extraction, et à l’analyser avec les fractions séparées ; Cette méthode assurerait la libération de symbiotes à partir des tissus de l’hôte, mais augmenterait le risque d’erreur humaine et/ou de perte de métabolites48. Il est possible d’analyser les fractions séparément et d’intégrer les données après analyse, mais les calculs devraient prendre en compte la proportion de cellules symbiotiques et hôtes dans l’holobionte corallien d’origine.
Bien qu’il soit possible d’obtenir plus d’informations en séparant les fractions de l’hôte et du symbiote pour l’analyse des métabolites, en particulier en termes de contributions individuelles des membres au métabolisme et à la fonction de l’holobionte, la question de savoir s’il faut séparer l’hôte et le symbiote plutôt que d’analyser l’holobionte est en fin de compte une décision régie par la question de recherche. Par exemple, l’analyse du profil métabolitique de l’holobionte est pertinente lorsque d’autres mesures physiologiques sont prises avec l’holobionte (par exemple, l’analyse des émissions de métabolites volatils des colonies de coraux 49,50,51) et lorsque les profils métabolomiques doivent être intégrés aux ensembles de données holobiontes. De plus, la séparation de l’hôte et du symbiote n’est pas sans limites ; Par exemple, des étapes de manipulation supplémentaires peuvent interférer avec la stabilité des métabolites et entraîner une perte de données ou des effets confondants48.
De plus, il existe des étapes d’optimisation supplémentaires impliquées dans la procédure de séparation hôte-symbiote : 1) optimiser le nombre de lavages pour les espèces de coraux spécifiques ; et 2) l’identification de la biomasse optimale à extraire des deux fractions pour l’analyse GC-MS. Les deux étapes doivent être incluses avant que le traitement final de l’échantillon puisse commencer, ce qui augmente à la fois les besoins en consommables et en analyses en termes de matériaux, de temps et de coûts. Dans ce travail, la perte de métabolites de l’hôte et des extractions de symbiotes due aux étapes supplémentaires peut avoir contribué à l’abondance relative plus élevée de certains métabolites observés dans l’holobionte par rapport à l’hôte ou au symbiote, tels que l’acide glycolique, le 1-hexadécanol et l’acide dodécanoïque. Cependant, la grande variation au sein d’un même groupe dans le groupe holobionte pour ces métabolites est, comme nous l’avons mentionné, une autre raison de ces modèles observés.
L’application des approches métabolomiques, bien que relativement nouvelle, a eu un impact profond sur notre capacité à élucider la fonction de symbioses spécifiques. Par exemple, cette approche a mis en évidence l’apport de l’hormone de croissance du phytoplancton, l’acide indole-3 acétique, qui est synthétisée par les bactéries de la symbiose Pseudo-nitzschia multiseries-Sulfitobacter. De plus, cette approche a permis d’élucider la translocation dérivée de l’hôte et dérivée du symbiote dans les coraux 11,27,28,29, ce qui présente un potentiel passionnant pour la conservation et la restauration des récifs coralliens3, par exemple grâce à la détection de biomarqueurs 19. Ici, nous avons fourni une procédure pour les deux approches dans l’espoir que cela facilitera et accélérera l’application de la métabolomique pour les futures études sur les récifs coralliens.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
J.L.M. a bénéficié d’une bourse de recherche du chancelier de l’UTS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
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