הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מקיפה להערכת הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון של סלידרוזיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7.
Salidroside (Sal) מכיל פעילויות פרמקולוגיות אנטי מסרטנות, אנטי היפוקסיסיות ואנטי דלקתיות. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים שלה נגד סרטן השד הובהרו רק באופן חלקי. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לפענח את הפוטנציאל של Sal בוויסות מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 בהתפשטות הממאירה של תאי MCF-7 של סרטן השד האנושי. ראשית, הפעילות הפרמקולוגית של Sal כנגד MCF-7 הוערכה על ידי CCK-8 ומבחני שריטות תאים. יתר על כן, העמידות של תאי MCF-7 נמדדה על ידי מבחני הגירה ופלישה מטריגל. עבור אפופטוזיס של תאים ומבחני מחזור, תאי MCF-7 עובדו בשלבים עם ANNEXIN V-FITC/PI וערכות זיהוי צביעת מחזור התא לניתוח ציטומטריית זרימה, בהתאמה. רמות מיני החמצן הריאקטיבי (ROS) ו-Ca2+ נבדקו על ידי DCFH-DA וצביעה אימונופלואורסצנטית Fluo-4 AM. הפעילות של Na+-K+-ATPase ו- Ca2+-ATPase נקבעה באמצעות ערכות מסחריות מתאימות. רמות החלבון וביטוי הגנים באפופטוזיס ובמסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 נקבעו עוד יותר באמצעות ניתוחי כתם מערבי ו- qRT-PCR, בהתאמה. מצאנו כי טיפול Sal הגביל באופן משמעותי את ההתפשטות, הנדידה והפלישה של תאי MCF-7 עם השפעות תלויות מינון. בינתיים, ממשל סאל גם אילץ באופן דרמטי תאי MCF-7 לעבור אפופטוזיס ומעצר מחזור תאים. בדיקות האימונופלואורסנציה הראו כי Sal עורר באופן נצפה ייצור ROS ו- Ca2+ בתאי MCF-7. נתונים נוספים אישרו כי סאל קידם את רמות הביטוי של חלבונים פרו-אפופטוטיים, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, ואת הגנים המתאימים להם. באופן עקבי, התערבות Sal הפחיתה באופן בולט את הביטוי של חלבוני Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α ו-FoxO1 ואת הגנים המתאימים להם. לסיכום, Sal יכול לשמש כתרכובת פוטנציאלית שמקורה בצמחי מרפא לטיפול בסרטן השד, שכן הוא עשוי להפחית את ההתפשטות, הנדידה והפלישה הממאירה של תאי MCF-7 על ידי עיכוב מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
כאחד מסוגי הסרטן המאובחנים הנפוצים ביותר והממאירויות הנפוצות ביותר, הנתונים הסטטיסטיים האחרונים מצביעים על כך ש -2.3 מיליון מקרים של סרטן השד הופיעו ברחבי העולם עד שנת 2020, המהווים 11.7% מכלל מקרי הסרטן1. תסמינים נפוצים של סרטן השד כוללים רגישות ועקצוץ בשדיים, גושים וכאבים בשדיים, הפרשות פטמות, שחיקה או עור שקוע, ובלוטות לימפה מוגדלותבבית השחי 1,2. מדאיג עוד יותר, מספר המקרים החדשים וההיארעות הכוללת של סרטן השד ממשיכים לעלות בקצב מכריע מדי שנה, ומהווים 6.9% ממקרי המוות הקשורים לסרטן1. כיום, התערבות בסרטן השד עדיין כוללת בעיקר כימותרפיה, ניתוח, הקרנות וטיפול מקיף. למרות שהטיפול יכול להפחית ביעילות את שיעור ההישנות והתמותה של החולים, יישום טיפול ארוך טווח גורם לעיתים קרובות לייצר עמידות לתרופות רבות, נשירת שיער בשטח גדול, בחילות והקאות, ועומס נפשי ופסיכולוגי חמור 2,3. יש לציין כי הסיכון הפוטנציאלי לגרורות איברים מרובות מסרטן השד מאלץ גם אנשים לחפש מקורות צמחיים חדשים לטיפול תרופתי 4,5.
איתות בתיווך Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) מעורב בגדילה, שגשוג והישרדות של סרטן השד באמצעות שחבור המשפיע על ביטוי של גנים מרובים6. כחלבון חישת אותות במורד הזרם של PI3K, ראיות רבות מצביעות על כך שחלבון קינאז B (AKT) יכול להזדווג עם המטרה של יונקים של חלבון רפמיצין (mTOR) כדי להגדיל עוד יותר את סרטן השד 7,8,9. יתר על כן, נטרול איתות PI3K/AKT/mTOR נטען גם כמרכיב מרכזי בתרופות המעכבות התפשטות ממאירה וממריצות אפופטוזיס בסרטן השד10,11,12. ידוע היטב כי היפוקסיה קיצונית במיקרו-סביבה של הגידול מאלצת גל מסיבי בגורם 1 אלפא (HIF-1α), אשר מחמיר עוד יותר את התקדמות סרטן השד13,14,15. במקביל, גירוי AKT מוביל גם להצטברות יתר של HIF-1α, המגביל אפופטוזיס בדגימות סרטן השד16,17. באופן מעניין, ההפעלה של איתות PI3K-AKT-HIF-1α אושרה כמעורבת בהתקדמות פתולוגית וגרורות במגוון סוגי סרטן, כולל סרטן ריאות18, סרטן המעי הגס19, סרטן השחלות20 וסרטן הערמונית21. בנוסף להיותו מתוזמר על ידי HIF-1α, ביטוי יתר של גורם שעתוק ראש מפוצל 1 (FoxO1) מופעל גם על ידי גירוי איתות AKT, המקדם מעצר מחזור ועיכוב אפופטוזיס בתאי סרטן השד22,23. יחד, הראיות המוצקות לעיל מצביעות על כך שעיכוב מפל האיתות PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 עשוי להיות מטרה פוטנציאלית חדשה לטיפול תרופתי בסרטן השד.
Salidroside (Sal) הוכח באופן נרחב להפעיל אנטי סרטן 24,25, אנטי היפוקסיה26,27,28,29, ופעילויות פרמקולוגיות לשיפור החיסון30. זוהי אבקה חומה בהירה או חומה כי הוא מסיס בקלות במים, הוא סוג של גליקוזיד phenylethanoid ויש לו נוסחת מבנה כימי של C14H 20 O7 ומשקל מולקולרי של300.331,32. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הוכיחו כי סאל יכול לקדם אפופטוזיס של תאי סרטן קיבה על ידי ריסון PI3K-AKT-mTOR איתות24. ראיות נוספות מצביעות גם על כך שדיכוי איתות PI3K-AKT-HIF-1α על ידי טיפול סאל עשוי לתרום לאפופטוזיס של תאים סרטניים על ידי שיפור רגישותם לחומרים כימותרפיים25. ראיות מצביעות גם על כך שסאל מגביל נדידת תאים ופלישה וגורם למעצר מעגלי על ידי קידום אפופטוזיס בתאי MCF-7 של סרטן השד האנושי33,34. עם זאת, נותר לראות אם Sal יכול לווסת איתות PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 ולעכב את ההתפשטות הממאירה של תאי MCF-7. לכן, פרוטוקול זה נועד לחקור את ההשפעות של Sal על נדידת תאי MCF-7, פלישה, מחזור התא ואפופטוזיס באמצעות מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. אסטרטגיות המחקר המשולבות הכוללות ניסויים קונבנציונליים, זולים ועצמאיים, כגון נדידת תאים והערכות פלישה, אפופטוזיס וזיהוי מחזור התא על ידי ציטומטריית זרימה, מיני חמצן תגובתי (ROS) וקביעת פלואורסצנטיות Ca2+ וכו ‘, יכולות לספק התייחסות לתכנון הכולל של ניסויים למחקר אנטי סרטני עם רפואת צמחים מסורתית. התהליך הניסויי של המחקר הזה מוצג באיור 1.
סרטן השד משפיע על אנשים בכל הגילאים וגורם לעומס פיזי ונפשי בל יתואר ולחץ כלכלי גדול1. סרטן השד, עם התחלואה והתמותה ההולכות וגדלות שלו מדי שנה, משך תשומת לב עולמית גם במונחים של חיפוש טיפולים מורכבים מבוססי צמחי מרפא יעילים מעבר לטיפולים קונבנציונליים 4,5<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי ועדת הבריאות של מחוז סצ’ואן (120025).
1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
Flow cytometer | BD | FACSCanto ![]() |
|
Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
Matrigel | Thermo | 356234 | |
mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |