MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구
Summary
본 프로토콜은 MCF-7 세포 증식 및 이동을 억제하는 살리드로사이드의 약리학적 작용 및 기전을 평가하기 위한 포괄적인 전략을 설명합니다.
Abstract
Salidroside (Sal)는 항 발암성, 항 저산소 및 항 염증 약리 활성을 포함합니다. 그러나, 그것의 근본적인 반대로 유방암 기계장치는 단지 불완전하게 해명되었다. 따라서 이 프로토콜은 인간 유방암 MCF-7 세포의 악성 증식에서 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 조절하는 Sal의 잠재력을 해독하기 위한 것입니다. 먼저, MCF-7에 대한 Sal의 약리활성을 CCK-8 및 세포 스크래치 분석으로 평가하였다. 또한, MCF-7 세포의 내성은 이동 및 Matrigel 침습 분석에 의해 측정되었습니다. 세포 사멸 및 주기 분석을 위해 MCF-7 세포는 각각 유세포 분석을 위해 annexin V-FITC/PI 및 세포 주기 염색 검출 키트를 사용하여 단계적으로 처리되었습니다. 활성 산소종(ROS) 및 Ca2+의 수준은 DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 면역형광 염색으로 검사되었습니다. Na+-K+-ATPase 및 Ca2+-ATPase의 활성은 해당 상용 키트를 사용하여 측정하였다. 세포사멸 및 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로의 단백질 및 유전자 발현 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석을 사용하여 추가로 측정되었습니다. Sal 치료는 용량 의존적 효과로 MCF-7 세포의 증식, 이동 및 침입을 유의하게 제한한다는 것을 발견했습니다. 한편, Sal 투여는 MCF-7 세포가 세포사멸(apoptosis)과 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 겪도록 극적으로 강제했다. 면역형광 검사는 Sal이 MCF-7 세포에서 ROS 및 Ca2+ 생산을 관찰할 수 있게 자극하는 것으로 나타났습니다. 추가 데이터는 Sal이 pro-apoptotic 단백질, Bax, Bim, 절단된 caspase-9/7/3 및 해당 유전자의 발현 수준을 촉진한다는 것을 확인했습니다. 일관되게 Sal 중재는 Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α 및 FoxO1 단백질과 해당 유전자의 발현을 현저하게 감소시켰습니다. 결론적으로, Sal은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 억제하여 MCF-7 세포의 악성 증식, 이동 및 침입을 줄일 수 있기 때문에 유방암 치료를 위한 잠재적인 허브 유래 화합물로 사용할 수 있습니다.
Introduction
가장 흔하게 진단되는 암 및 가장 흔한 악성 종양 중 하나인 유방암은 최신 통계에 따르면 2020년까지 전 세계적으로 230만 건의 유방암이 발생하여 전체암 사례의 11.7%를 차지합니다1. 유방암의 일반적인 증상으로는 유방 압통과 따끔거림, 유방 덩어리 및 통증, 유두 분비물, 미란 또는 함몰된 피부, 겨드랑이 림프절 비대증등이 있다 1,2. 더욱 우려스러운 것은 유방암의 신규 발병 건수와 전체 발병률이 매년 압도적인 비율로 계속 증가하여 암 관련 사망의 6.9%를 차지한다는 것입니다1. 현재 유방암 중재는 여전히 주로 화학 요법, 수술, 방사선 요법 및 포괄적 인 치료를 포함합니다. 치료는 환자의 재발률과 사망률을 효과적으로 낮출 수 있지만, 장기간의 치료는 종종 다제내성, 대면적 탈모, 메스꺼움 및 구토, 심각한 정신적, 심리적 부담을 유발한다 2,3. 특히, 유방암으로 인한 다발성 장기 전이의 잠재적 위험으로 인해 사람들은 약물 요법의 새로운 약초 공급원을 찾게 된다 4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) 매개 신호전달은 여러 유전자의 발현에 영향을 미치는 스플라이싱을 통해 유방암의 성장, 증식 및 생존에 관여한다6. PI3K의 다운스트림 신호 감지 단백질인 단백질 키나아제 B(AKT)가 포유류 표적인 라파마이신(mTOR) 단백질과 결합하여 유방암을 더욱 증가시킬 수 있다는 수많은 증거가 있습니다 7,8,9. 또한, PI3K/AKT/mTOR 신호전달의 비활성화는 유방암에서 악성 증식을 억제하고 세포사멸을 자극하는 약물의 핵심 성분이라고 주장되어 왔다10,11,12. 종양 미세환경에서의 극심한 저산소증은 저산소증 유발 인자 1 알파(HIF-1α)의 급증을 강요하며, 이는 유방암의 진행을 더욱 악화시킨다는 것은 잘 알려져 있다13,14,15. 동시에, AKT 자극은 또한 HIF-1α의 과도한 축적을 유도하여, 유방암 샘플에서 세포사멸을 제한한다16,17. 흥미롭게도, PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 활성화는 폐암18, 대장암19, 난소암20, 전립선암21을 포함한 다양한 암에서 병리학적 진행 및 전이에 관여하는 것으로 확인되었다. HIF-1α에 의해 조율되는 것 외에도 갈래 머리 전사 인자 1(FoxO1) 과발현은 AKT 신호 자극에 의해 유발되며, 이는 주기 정지 및 유방암 세포의 세포 사멸 억제를 촉진합니다22,23. 위의 확실한 증거는 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달의 캐스케이드 억제가 유방암에서 약물 요법을 위한 잠재적인 새로운 표적이 될 수 있음을 시사합니다.
Salidroside (Sal)는 항암 24,25, 항 저산소증26,27,28,29 및 면역 강화 약리 활성30을 발휘하는 것으로 널리 입증되었습니다. 물에 쉽게 용해되는 밝은 갈색 또는 갈색 분말이며 페닐에탄노이드 배당체의 일종이며 화학 구조식은 C14H 20 O7이고 분자량은300.331,32입니다. 현대의 약리학적 연구는 Sal이 PI3K-AKT-mTOR 신호전달을 억제함으로써 위암 세포의 세포사멸을 촉진할 수 있음을 입증했다24. 추가 증거는 또한 Sal 치료에 의한 PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 억제가 화학요법제에 대한 암세포의 감수성을 향상시킴으로써 암세포의 세포사멸에 기여할 수 있음을 시사한다25. 증거는 또한 Sal이 세포 이동 및 침입을 제한하고 인간 유방암 MCF-7 세포33,34에서 세포 사멸을 촉진하여 주기 정지를 유발한다는 것을 시사합니다. 그러나 Sal이 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달을 조절하고 MCF-7 세포의 악성 증식을 억제할 수 있는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 따라서 이 프로토콜은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 통해 MCF-7 세포 이동, 침입, 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 Sal의 효과를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 세포 이동 및 침습 평가, 유세포 분석에 의한 세포 사멸 및 세포 주기 검출, 활성 산소 종(ROS) 및 Ca2+ 형광 측정 등과 같은 기존의 저비용 및 독립적인 실험으로 구성된 통합 연구 전략은 전통 한약을 사용한 항암 연구를 위한 전반적인 실험 설계에 대한 참고 자료를 제공할 수 있습니다. 이 연구의 실험 과정은 그림 1에 나와 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유방암은 모든 연령대의 개인에게 영향을 미치며 헤아릴 수 없는 신체적, 정신적 부담과 큰 경제적 압박을 유발합니다1. 매년 이환율과 사망률이 증가하는 유방암은 기존 치료법을 넘어 효과적인 한방 기반 복합 요법을 찾는 측면에서 전 세계적으로 주목을 받고 있습니다 4,5. 유망하게도, Sal24,25,38<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 쓰촨성 건강위원회(120025)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
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