Utforska den farmakologiska verkan och molekylära mekanismen för salidosid för att hämma MCF-7-cellproliferation och migration
Summary
Detta protokoll beskriver en omfattande strategi för att utvärdera den farmakologiska effekten och mekanismen för salidosid för att hämma MCF-7-cellproliferation och migration.
Abstract
Salidrosid (Sal) innehåller anticancerframkallande, antihypoxiska och antiinflammatoriska farmakologiska aktiviteter. Dess underliggande mekanismer mot bröstcancer har dock bara klarlagts ofullständigt. Därför avsåg detta protokoll att avkoda Sals potential för att reglera PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen i den maligna proliferationen av humana bröstcancer MCF-7-celler. Först utvärderades den farmakologiska aktiviteten av Sal mot MCF-7 med CCK-8 och cellskrapanalyser. Dessutom mättes resistensen hos MCF-7-celler genom migrations- och Matrigel-invasionsanalyser. För cellapoptos och cykelanalyser bearbetades MCF-7-celler i steg med annexin V-FITC/PI respektive cellcykelfärgningsdetektionskit för flödescytometrianalyser. Nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) och Ca2+ undersöktes med DCFH-DA och Fluo-4 AM immunofluorescensfärgning. Aktiviteterna för Na+-K+-ATPas och Ca2+-ATPas bestämdes med hjälp av motsvarande kommersiella kit. Protein- och genuttrycksnivåerna i apoptos och PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen bestämdes ytterligare med hjälp av western blot- respektive qRT-PCR-analyser. Vi fann att Sal-behandling signifikant begränsade proliferation, migration och invasion av MCF-7-celler med dosberoende effekter. Samtidigt tvingade Sal-administrationen också dramatiskt MCF-7-celler att genomgå apoptos och cellcykelstopp. Immunofluorescenstesterna visade att Sal observerbart stimulerade ROS- och Ca2+-produktionen i MCF-7-celler. Ytterligare data bekräftade att Sal främjade uttrycksnivåerna av pro-apoptotiska proteiner, Bax, Bim, klyvt kaspas-9/7/3 och deras motsvarande gener. Konsekvent minskade Sal-interventionen tydligt uttrycket av proteinerna Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α och FoxO1 och deras motsvarande gener. Sammanfattningsvis kan Sal användas som en potentiell örthärledd förening för behandling av bröstcancer, eftersom det kan minska den maligna proliferationen, migrationen och invasionen av MCF-7-celler genom att hämma PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen.
Introduction
Som en av de vanligaste cancerdiagnoserna och de vanligaste maligniteterna visar den senaste statistiken att 2,3 miljoner fall av bröstcancer uppstod runt om i världen år 2020, vilket motsvarar 11,7 % av alla cancerfall1. Vanliga symtom på bröstcancer är ömhet och stickningar i brösten, knölar och smärta i bröstvårtorna, rinnande bröstvårtor, erosion eller insjunken hud samt förstorade lymfkörtlari armhålan 1,2. Ännu mer alarmerande är att antalet nya fall och den totala förekomsten av bröstcancer fortsätter att öka i en överväldigande takt varje år och står för 6,9 % av de cancerrelateradedödsfallen1. För närvarande omfattar bröstcancerintervention fortfarande främst kemoterapi, kirurgi, strålbehandling och omfattande behandling. Även om behandling effektivt kan minska återfallsfrekvensen och dödligheten hos patienter, orsakar långvarig behandlingstillämpning ofta multiresistens, håravfall på stora områden, illamående och kräkningar samt allvarlig mental och psykologisk börda 2,3. Den potentiella risken för multipla organmetastaser från bröstcancer tvingar också människor att söka nya växtbaserade källor för läkemedelsbehandling 4,5.
Fosfoinositid 3-kinas (PI3K)-medierad signalering är inblandad i tillväxt, proliferation och överlevnad av bröstcancer genom splitsning som påverkar uttrycket av flera gener6. Som ett nedströms signalavkännande protein av PI3K tyder många bevis på att proteinkinas B (AKT) kan kopplas till däggdjursmålet för rapamycin (mTOR) protein för att ytterligare öka bröstcancer 7,8,9. Dessutom har inaktiveringen av PI3K/AKT/mTOR-signalering också påståtts vara en nyckelkomponent i läkemedel som hämmar malign proliferation och stimulerar apoptos vid bröstcancer10,11,12. Det är välkänt att extrem hypoxi i tumörens mikromiljö tvingar fram en massiv ökning av hypoxi-inducerbar faktor 1 alfa (HIF-1α), vilket ytterligare förvärrar utvecklingen av bröstcancer13,14,15. Parallellt leder AKT-stimulering också till överdriven ackumulering av HIF-1α, vilket begränsar apoptos i bröstcancerprover16,17. Intressant nog har aktiveringen av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering bekräftats vara involverad i patologisk progression och metastasering i en mängd olika cancerformer, inklusive lungcancer18, kolorektal cancer19, äggstockscancer20 och prostatacancer21. Förutom att orkestreras av HIF-1α, utlöses överuttryck av transkriptionsfaktor 1 (FoxO1) med gaffelhuvud också av AKT-signalstimulering, vilket främjar cykelstopp och hämning av apoptos i bröstcancerceller22,23. Sammantaget tyder ovanstående solida bevis på att hämningen av kaskaden av PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering kan vara ett potentiellt nytt mål för läkemedelsbehandling vid bröstcancer.
Salidroside (Sal) har i stor utsträckning visat sig utöva anti-cancer24,25, anti-hypoxi26,27,28,29 och immunstärkande farmakologiska aktiviteter30. Det är ett ljusbrunt eller brunt pulver som är lättlösligt i vatten, är en typ av fenyletanoidglykosid och har en kemisk strukturformel på C14H 20 O7 och en molekylvikt på300,331,32. Moderna farmakologiska undersökningar har visat att Sal kan främja apoptos av magcancerceller genom att begränsa PI3K-AKT-mTOR-signalering24. Ytterligare bevis tyder också på att undertryckandet av PI3K-AKT-HIF-1α-signalering genom Sal-behandling kan bidra till apoptos av cancerceller genom att öka deras känslighet för kemoterapeutiska medel25. Bevis tyder också på att Sal begränsar cellmigration och invasion och orsakar cykelstopp genom att främja apoptos i den humana bröstcancern MCF-7-celler33,34. Det återstår dock att se om Sal kan reglera PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-signalering och hämma den maligna proliferationen av MCF-7-celler. Därför syftade detta protokoll till att utforska effekterna av Sal på MCF-7-cellmigration, invasion, cellcykel och apoptos via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1-vägen. De integrerade forskningsstrategierna som omfattar konventionella, billiga och oberoende experiment, såsom cellmigration och invasionsbedömningar, apoptos och cellcykeldetektion genom flödescytometri, reaktiva syrearter (ROS) och Ca2+ fluorescensbestämning, etc., kan ge en referens för den övergripande utformningen av experiment för anti-cancerforskning med traditionell örtmedicin. Den experimentella processen för denna studie visas i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bröstcancer drabbar individer i alla åldrar och orsakar oöverskådlig fysisk och psykisk börda och stor ekonomisk press1. Bröstcancer, med dess ökande sjuklighet och dödlighet varje år, har också väckt uppmärksamhet över hela världen när det gäller att söka effektiva växtbaserade sammansatta terapier utöver konventionella behandlingar 4,5. Lovande nog har en stor mängd bevis avslöjat anti-cancereffekterna av Sal<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av hälsokommissionen i Sichuanprovinsen (120025).
Materials
| 1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
| Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
| Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
| cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
| cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
| Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
| ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
| Flow cytometer | BD | FACSCanto  |
|
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
| HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
| Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
| Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | 356234 | |
| mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
| Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
| Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
| p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
| p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
| Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
| SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
- Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
- Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
- Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
- Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Ricerca sul cancro. 82 (12), 2269-2280 (2022).
- Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
- Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
- Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
- Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
- Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
- Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
- Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
- You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
- La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
- Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
- Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
- Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
- Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
- Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
- Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
- Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
- Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
- Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
- Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
- Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
- Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
- Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
- Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
- Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
- Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
- Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
- Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
- Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research – Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
- Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
- Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
- Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
- Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).
