Summary
여기에 제시된 실험 설계는 림프절(LN) 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 연구에 유용한 생식 모델을 제공하며, 이는 방관자 CD8+ T 세포의 섭동을 배제합니다.
Abstract
림프절 배액의 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포는 종양 형성 중 항종양 면역 반응을 증가시키는 데 축적되는 중요성을 얻습니다. 그러나 많은 경우 암세포는 림프절에서 전이성 유전자좌를 형성한 후 멀리 떨어진 장기로 전이됩니다. 국소 및 체계적인 CD8+ T 세포 반응이 LN 전이에 의해 어느 정도 영향을 받았는지는 아직 불분명합니다. 이를 위해 림프구성 맥락막염 바이러스(LCMV), 당단백질(GP) 및 클래스 I 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 H-2Db에 의해 제시된 GP 유래 펩타이드 GP33-41에 특이적인 T세포 수용체(TCR)를 보유한 P14 형질전환 마우스에서 유래한 대리 신생항원을 발현하는 B16F10-GP 흑색종 세포주와 결합된 murine LN 전이 모델을 설정했습니다. 이 프로토콜은 LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 C57BL/6J 마우스에 B16F10-GP 세포를 피하 이식한 후 naive P14 세포로 입양 이식했습니다. 피하종양이 직경 약 5mm까지 커지면 원발성 종양을 절제하고, B16F10-GP 세포를 종양 배액 림프절(TdLN)에 직접 주입하였다. 그런 다음 LN 전이 과정에서 CD8+ T 세포의 역학을 모니터링했습니다. 종합적으로, 이 모델은 LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 정밀하게 조사하기 위한 접근 방식을 제공했습니다.
Introduction
암 면역 요법, 특히 면역 관문 차단(ICB)은 암 치료에 혁명을 일으켰습니다1. ICB는 종양미세환경(TME)에서 소진된 CD8+ T 세포에서 많이 발현되는 동산화 면역 수용체(PD-1, Tim-3, LAG-3, TIGIT 등)를 차단하여 소진된 CD8+ T 세포를 활성화시킨다2. 소진된 CD8+ T 세포의 이질성을 고려할 때, 축적된 증거에 따르면 TME가 아닌 배액 림프절(dLN)을 포함하여 말초에서 유래한 종양 특이적 CD8+ T 세포가 ICB 3,4,5,6,7,8의 효능을 매개하는 것으로 나타났습니다. 최근 TdLN 유래 TCF-1+TOX- 종양 특이적 기억 CD8+ T세포(TdLN-TTSM)는 기존 기억 T세포의 여러 기능적 특성을 구현하고 ICB 처리 시 자손 소진 세포로 더욱 확장 및 분화할 수 있는 ICB에 대한 진정한 반응체임이 확인되었다9. 전체적으로, 이러한 발견은 항종양 면역을 강화하는 데 있어 LN의 중요성을 확증했습니다.
림프절은 생물학적 신호뿐만 아니라 구조적 기초를 제공함으로써 종양 특이적 CD8+ T 세포의 프라이밍 및 활성화를 촉진하는 중요한 역할을 한다10. 여러 종류의 암세포는 체계적인 전파 전에 감시림프절(SLN, 원발성 종양을 배출하는 첫 번째 LN)을 심는 경우가 많다11. SLN 전이의 존재는 인간 암에서 좋지 않은 결과와 관련이 있으며 전임상 모델은 TdLN의 종양 세포가 림프관과 결절 12,13,14,15의 혈관을 통해 먼 장기로 퍼질 수 있음을 보여주었습니다. SLN 생검은 이제 많은 고형 종양 유형에서 후속 치료 결정을 안내하는 표준 절차로, 침범되지 않은 LN16,17의 불필요한 절제를 피할 수 있습니다. 침범된 LN의 경우에도, 국소 LN을 제거했을 때 국소 LN 절제술을 받지 않은 환자에 비해 전체 생존율이 개선되지 않았다는 것이 여러 연구에서 입증되었기 때문에 외과적 절제가 필요한지 여부와 시기에 대해서는 여전히 논란의 여지가 있다18,19. 한 가지 해석은 미세한 질병이 있는 전이성 LN(mLN)이 면역 세포를 교육하고 일부 치료 이점을 제공할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 것입니다. 따라서 LN 전이가 항종양 면역 반응, 특히 TdLN-TTSM의 특성과 기능에 어떤 영향을 미치는지 밝히는 것이 매우 중요합니다.
지금까지 전임상 및 임상 데이터 모두에서 mLN20의 일부 구조적 및 세포 변화가 밝혀졌습니다. 그러나 LN 전이 중 종양 특이적 CD8+ T 세포의 동적 변화는 설명되지 않았습니다. 따라서 추가 연구를 위해 LN 전이에 대한 설득력 있는 모델을 개발해야 합니다. 실제로, 여러 연구에서 다양한 방식으로 mLN 마우스 모델을 보고했습니다 14,21,22. 예를 들어, 겨드랑이 LN에서의 자발적 전이는 4T1 유방암 세포를 유방 지방 패드(22)에 이식함으로써 수행되었다. 또 다른 연구에서 Reticker-Flynn 등은 해리된 mLN 조직에서 배양된 종양 세포의 연속 접종(9회)을 통해 피하 원발성 종양에서 LN으로 확산될 확률이 높은 흑색종 세포주를 생성했습니다14. 일반적으로 사용되는 또 다른 모델은 종양 세포를 발판에 주입하여 제조되었으며 전이성 유전자좌는 오금 LN22에서 형성됩니다. 특히, 이러한 모델에서 LN 전이가 항상 충실한 것은 아니기 때문에 정확한 개입 시점을 평가하기가 어렵습니다.
본 연구에서는 B16F10 세포주9의 게놈에 LCMV 바이러스 당단백질(GP) 유전자 서열을 CRISPR/Cas9 매개 삽입하여 생성된 B16F10-GP 세포23,24의 결절내 주입을 통해 murine LN 전이성 모델을 확립했습니다. 그런 다음, 이들 마우스는 H-2Db GP33-41 에피토프25,26을 특이적으로 인식하는 형질전환 T 세포 수용체(TCR)를 보유하는 P14 세포로 옮겨졌고 LN 전이 동안 항원 특이적 CD8+ T 세포의 전신 및 국소 역학을 조사할 수 있었습니다. 당사의 실험 설계는 면역 반응, 특히 방관자 CD8+ T 세포의 섭동을 배제하는 LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 연구에 유용한 모델을 제공합니다. 이러한 결과는 mLN을 제거할지 또는 유지할지에 대한 임상 치료 옵션에 영향을 미치고 최대 치료 효과를 달성하기 위해 mLN을 조작하는 방법에 대한 새로운 빛을 비출 것입니다.
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Protocol
사용된 C57BL/6J 마우스(B6 마우스라고 함) 및 나이브 P14 형질전환 마우스(9,27)는 6-10주령의 체중 18-22g이었다. 남성과 여성 모두 무작위 배정이나 눈가림 없이 포함되었습니다. 모든 동물 연구는 칭다오 농업 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 배지 및 시약의 준비
- DMEM, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민과 100U/mL 퓨로마이신을 추가하여 D10(완전 DMEM 배지)이라는 B16F10-GP 흑색종 세포 배양 배지를 준비합니다. 멸균 D10을 유지하고 2-4 °C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
- 2% FBS, 1640% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민과 함께 1%의 RPMI-1을 첨가하여 R1 배지(적혈구 용해 종료용)를 준비합니다.
- 2% FBS 및 0.01%의 아지드화나트륨이 포함된 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 준비합니다. 아지드화 나트륨을 첨가하면 FACS 완충액의 보관 시간을 연장 할 수 있으며, 이는 2-4 ° C에서 수개월 동안 보관 될 수 있습니다.
- 이중 증류수에 155mMNH4Cl, 10mMKHCO3, 0.1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 첨가하여 적혈구 용해(RBL) 완충액을 제조하고 pH를 7.3으로 조정합니다. RBL 완충액을 실온(RT)에 보관하면 최대 3개월 동안 안정적으로 유지됩니다.
- 마취제인 2,2,2-트리브로모에탄올을 아래에 설명된 대로 준비한다.
- 알루미늄 호일로 감싼 50mL 멸균 원뿔형 튜브에 적절한 양의 2,2,2-트리브로모에탄올 결정을 칭량합니다. 결정체에 적당량의 2-메틸-2-부탄올을 첨가하여 500mg/mL의 농도로 원액을 준비합니다.
- 크리스탈이 녹을 때까지 37°C 수조에서 튜브를 혼합하고 가열하기 위해 소용돌이칩니다. 모든 결정이 녹았는지 확인하십시오.
- 용액을 잘 섞는다. 0.22μm 필터로 원액을 멸균 용기에 여과합니다. 원액을 -20 °C에서 냉동, 빛으로부터 차폐하여 보관하거나 PBS로 희석하여 12.5mg/mL 농도의 작업 용액에 넣고 4 °C에서 보관합니다.
알림: 높은 농도의 액체는 자극적이므로 처방된 농도를 사용하는 것이 가장 좋습니다.
2. B16F10-GP 세포 현탁액의 제조
- 37 °C 및 5 % CO 2의 세포 배양 인큐베이터에서 5 mL의 D10으로 1 x 106 개의 B16F10-GP 세포 바이알을 해동하고 배양합니다. 하부 배양 세포가 80% 내지 90% 밀도에 도달했을 때의 세포.
- 피펫팅 건으로 흡인하여 원래 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 2회 세척합니다. 세포 배양 접시에서 PBS로 부착 세포를 세척할 때 PBS를 측벽으로 옮기거나 접시에 떨어뜨립니다.
- PBS 흡인 후 0.5-1mL의 0.25% 트립신 EDTA 용액을 세포 배양 접시 또는 플라스크에 추가합니다. 세포 표면 전체를 덮을 수 있도록 부드럽게 흔듭니다. 세포 배양 접시 또는 플라스크를 37°C의 인큐베이터에 약 1분 동안 또는 세포가 둥글고 분리될 때까지 실온에서 둡니다. 도립 현미경을 사용하여 세포의 박리를 관찰합니다.
- 트립신 분해를 종료하기 위해 같은 양의 갓 제조된 D10을 첨가하십시오. 피펫팅 건으로 세포 배양 플라스크의 아래쪽 표면을 퍼지하여 모든 세포가 분리되었는지 확인합니다.
- B16F10-GP 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 RT에서 4분 동안 163 x g 의 속도로 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 버립니다. 침전을 위해 세포를 D10 1-2mL에 재현탁시킵니다. B16F10-GP 세포 현탁액을 8-10mL의 D10이 들어 있는 새로운 세포 배양 접시 또는 플라스크에 옮긴 다음 37°C의 세포 배양기에서 5%CO2로 배양합니다.
- 종양 이식 당일, 단계 2.1.1 내지 2.1.4에 기술된 바와 같이 약 90%의 밀도를 갖는 B16F10-GP 세포를 수집한다. 원심분리 후 상층액을 흡인하고 폐기합니다. 세포 침전물을 PBS 1mL에 재현탁시킵니다.
- 0.4% 트리판 블루 혈구분석기를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다. PBS를 추가하여 세포를 100μL당 5 x 105 세포로 희석합니다. 사용할 때까지 세포를 얼음 위에 놓습니다.
3. 마우스의 양측 서혜부 영역에서 B16F10-GP 세포의 이소성 접종
- 1mL 주사기를 사용하여 준비된 B16F10-GP 세포 현탁액 100μL를 흡입합니다. 튜브 벽을 튕겨 기포를 위로 이동시키고 피스톤을 밀어 상부 기포를 밖으로 내보냅니다.
- 마우스를 누운 자세로 잡고 복부를 노출시킵니다. 앙와위 자세에서 마우스의 오른쪽 뒷다리를 손가락으로 눌러 오른쪽 서혜부 부위의 피부가 완전히 드러나도록 합니다(왼쪽 서혜부 부위와 동일).
- 제모 크림으로 복부의 털을 제거한 다음 75% 에탄올이 함유된 면으로 양측 복부를 청소합니다.
- 바늘을 삽입하기 전에 사타구니 부위의 피부가 조여졌는지 확인하십시오. 허벅지 위쪽 서혜부 부위의 피하 공간에 바늘을 45° 각도로 삽입합니다. 바늘이 위쪽으로 비스듬하고 바늘 깊이가 0.5-1cm인지 확인하십시오.
- 주입 전에 부드러운 흡입을 가하고, 혈액이 없으면 피하 조직에 천천히 주입 된 세포를 주입합니다. 동시에 피하 부위에 작은 볼루스(체액 주머니 형성)를 관찰합니다.
- 주사 후 바늘을 제거하고 날카로운 물건 상자에 넣고 마우스를 케이지로 되돌립니다.
4. P14 T 세포를 종양이 있는 마우스로 입양 전달
- 종양 이식 후 6-8일 후 종양이 만져질 수 있을 때(직경 약 3-5mm) 종양이 있는 마우스에서 입양 이식을 수행합니다. 복강내 주사 전날 4mg의 사이클로포스파미드 28,29,30.
참고: CTX 주사의 목적은 증식하는 림프구를 일시적으로 제거하여 입양 전이 T 세포를 위한 림프칸에 공간을 만드는 것입니다. - 아래에 기술된 바와 같이 순진한 P14 형질전환 마우스의 비장 및 LN으로부터 림프구를 분리한다31,32 (6-10주령, 거부 반응을 피하기 위해 종양이 있는 마우스와 동일한 성별).
알림: 엄격한 멸균 조건을 보장하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 다음 절차를 수행하십시오.- 6cm 접시 2개를 준비하고 접시 중 하나에 R2 배지 3mL를 넣고 다른 접시에 RBL 완충액 3mL를 추가합니다. RBL 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 70μm 셀 필터를 넣습니다.
- P14 마우스를 이소플루란이 포함된 밀폐 용기에 담아 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 실시합니다. 받는 마우스의 수에 따라 P14 마우스의 수를 조정합니다.
- 안락사된 쥐에서 비장, 서혜부 및 겨드랑이 림프절을 채취하여 4mL의 R2 배지가 들어 있는 6cm 접시에 옮겨 얼음 위에 놓습니다.
- 3mL의 RBL 완충액을 적신 여과기에 비장을 넣고 1mL 주사기 내부의 퍼터로 비장을 갈아줍니다. 세포를 RT에서 1-2분 동안 배양한 다음 3mL의 차가운 R2 배지로 반응을 종료합니다.
- 1μm 셀 필터가 있는 스트레이너에 결합 조직만 남을 때까지 70mL 주사기 내부의 퍼터로 LN을 갈아줍니다. 차가운 R2 배지로 필터를 헹구고 셀 현탁액을 새 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 500 x g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 3mL의 PBS로 세포를 재현탁시킵니다. 70μm 셀 필터를 사용하여 셀 현탁액에서 응집성 물질을 제거합니다.
- 셀 현탁액을 500 x g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다. 3mL의 PBS로 세포를 재현탁시키고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 작은 샘플을 채취하여 트리판 블루와 혼합하고 혈액 세포 계수 플레이트를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 유세포 분석을 통해 P14(살아있는/죽은 CD45.1+CD8+Vα2+) 세포의 비율을 측정합니다. 이식된 기증자 세포가 수혜자 마우스(종양 보유 B6 마우스는 CD45.2+)와 뚜렷한 동종 마커를 나타내는지 확인합니다. 이식된 세포의 올바른 표현형을 확인하기 위해 이식 전에 염색을 수행합니다.
- 1mL의 FACS 완충액이 들어 있는 1.5mL 원심분리 튜브에 5 x 104- 1 x 105 세포를 추가합니다. 셀 현탁액을 4°C, 500 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 튜브 바닥을 튕겨 세포를 분산시킨 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 100 μL의 FACS 완충액에 희석한 하기 공액 항체 혼합물 9,32를 제조한다: 항-CD8, 1:200; 안티 TCR Vα2, 1:100; 안티 CD45.1, 1:200; 살아있는 / 죽은 얼룩, 1:400. (재료 목차).
- 항체 혼합물을 15,000 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 입자를 응집합니다. 혼합물을 얼음 위에 놓고 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오. 입자의 흡인을 피하기 위해 상청액만 복용하십시오.
- 항체 혼합물 100μL에 세포를 재현탁시키고 튜브 벽을 튕겨 완전히 혼합합니다. 은박지로 싸서 얼음 위에서 30분 동안 튜브를 배양합니다.
- FACS 완충액으로 세포를 2번 세척합니다. 4°C에서 500 x g 으로 3분 동안 튜브를 원심분리합니다. 200μL의 FACS 완충액으로 세포를 재현탁시키고 세포 현탁액을 유동 튜브로 옮깁니다.
- 유세포 분석기에서 염색된 세포가 있는 유관을 실행하여 살아있는/죽은 CD45.1+CD8+Vα2+ 세포의 비율을 측정합니다.
참고: 일반적으로 P14 형질전환 마우스의 CD8+ T 세포의 90% 이상은 LCMV(림프구성 맥락막염 바이러스)의 H-2Db GP33-41 에피토프에 특이적인 Vα2+TCR을 보유하고 있습니다.
- 4.2단계와 4.3단계에서 얻은 백분율과 살아있는 세포 수를 곱하여 살아있는/죽은 CD45.1+CD8+Vα2+ 세포의 절대 수를 계산합니다.
- 100U 인슐린 주사기로 P14 세포(5 x 105 세포) 현탁액 200μL를 흡인하고 기포를 제거합니다. 전달된 나이브 P14 세포의 초기 수(5 x 10,3 - 5 x 10,5)는 전달된 세포의 표현형에 영향을 미치지 않았다9.
- 쥐를 케이지에 넣고 적외선 램프로 5-10분 동안 데워 꼬리 정맥을 확장합니다. 적절한 크기의 마우스 고정 장치로 제자리에 고정하고 꼬리를 곧게 펴고 75% 에탄올이 포함된 면봉으로 닦아 정맥이 보이도록 합니다.
- 바늘을 꼬리 정맥과 평행하게 삽입하고 플런저를 부드럽게 뒤로 당깁니다. 주사기로 혈액이 흐르면 세포 현탁액을 정맥으로 천천히 밀어 넣습니다.
알림: 주입 중 꼬리에 저항이나 부종이 있는 경우 주입 위치를 조정해야 합니다. 주사 부위는 말단부에서 시작해야 합니다. - 주입이 끝나면 바늘을 재빨리 빼고 화장솜으로 주사 부위를 부드럽게 누릅니다. 마우스를 깨끗한 새 케이지에 다시 넣고 부작용이 있는지 몇 분 동안 면밀히 관찰하십시오.
5. 원발성 종양의 절제
알림: 사용하기 전에 모든 수술 기구가 고압멸균되었는지 확인하십시오. 생물 안전 캐비닛 내부의 작업 영역을 75% 에탄올로 멸균한 다음 최소 30분 동안 UV 조사를 실시합니다. 수술 중에는 깨끗한 가운, 모자, 마스크 및 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 종양이 만져지면(직경 약 5mm) 원발성 종양을 절제합니다.
- 케타민(75mg/kg)의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 마취 정도를 평가하기 위해 발 패드를 꼬집고 통증 반사가 없으면 수술 타이밍을 나타냅니다. 뒷다리를 빼낸 경우 10-30μL를 더 투여합니다.
참고: 또는 복강 내 메데토미딘(체중 1mg/kg; Domitor)는 마우스를 마취하는 것이 좋습니다. - 쥐의 눈에 건조 예방 연고를 바릅니다. 제모 크림으로 복부의 털을 제거하여 수술 부위가 완전히 노출되도록 합니다.
- 마우스를 생물 안전 캐비닛에 놓고 깨끗한 흡수지로 덮인 해부학 보드에 올려 놓아 마우스의 세로 축이 실험자와 평행이 되도록 누운 자세로 놓습니다.
알림: 엄격한 멸균 환경을 유지하려면 생물 안전 작업대에서 다음 절차를 수행해야 합니다. - 포비돈 요오드에 적신 면봉으로 쥐의 복부를 소독합니다. 멸균 메스나 검안경 가위로 종양 보유 부위 근처의 피부를 절개합니다. 닫힌 가위 끝을 절개 부위에 삽입하여 종양이 명확하게 노출되도록 합니다. 피부를 절개할 때 서혜부 림프절이 손상되지 않도록 주의합니다.
- 종양을 제거하는 동안 캡슐을 가능한 한 손상되지 않은 상태로 유지하십시오. 멸균 가위로 종양에 인접한 결합 조직을 조심스럽게 부드럽게 제거합니다. 상피 내 종양을 완전히 제거하지 않으면 재발할 수 있습니다.
6. 사타구니 림프절에 B16F10-GP 세포의 결절 내 주입
참고: 양측 종양 제거 후 B16F10-GP 세포를 편측 서혜부 림프절에 주입하고 PBS를 반대쪽에 주입했습니다.
- 100U 인슐린 주사기로 B16F10-GP 세포 현탁액 20μL(5 x 104 세포)를 흡인하고 기포를 제거한 다음 서혜부 림프절 하나에 주입합니다. 반대쪽의 서혜부 림프절에 동일한 양의 PBS를 주입합니다.
- 주입 시 림프절의 말단부에서 바늘을 삽입한 후 림프절 중앙까지 천천히 바늘을 삽입합니다. 이때, 림프절에 체액을 정확하게 주입하면 림프절이 크게 부풀어 오르는 것을 볼 수 있다.
알림: 림프절의 말단부에서 바늘을 삽입할 때 림프절에 구멍이 뚫리지 않도록 하십시오.
- 주입 시 림프절의 말단부에서 바늘을 삽입한 후 림프절 중앙까지 천천히 바늘을 삽입합니다. 이때, 림프절에 체액을 정확하게 주입하면 림프절이 크게 부풀어 오르는 것을 볼 수 있다.
- 3-0 봉합사를 사용하여 2-3바늘로 절개 부위를 봉합합니다. 포비돈 요오드가 함침된 면으로 상처 주위의 피부를 소독합니다. 봉합 중 림프절을 우회하도록 주의하십시오.
- 마우스를 깨끗한 케이지에 넣고 측면 욕창 자세에서 적외선을 사용하여 따뜻하게 유지합니다. 의식이 회복될 때까지 지속적으로 모니터링하십시오. 수술을 받은 쥐가 완전히 회복될 때까지 다른 동물의 회사로 돌아가지 않도록 하십시오.
- 수술 후 통증을 완화하기 위해 수술 후 연속 3일 동안 4-6시간마다 부프레노르핀을 투여하십시오(0.1-0.5mg/kg, SQ 또는 IP의 용량으로). 쥐의 먹이, 마시기, 움직임 및 활동 영역을 모니터링합니다. 일반적으로 생쥐는 수술 외상에서 3일 이내에 회복됩니다.
알림: 쥐가 정상적인 먹이 및 활동을 재개할 수 없고 감염 징후를 보이면 수의사와 상담하여 개입하거나 안락사시키십시오. - 종양 세포의 결절 내 주입 후 8일과 18일이라는 서로 다른 시점에서 마우스를 희생합니다. 유세포 분석을 사용하여 활성화된 기증자 세포를 회수합니다.
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Representative Results
이 실험 설계의 개략도는 그림 1A에 나와 있습니다. PBS 100μL에 있는 총 5 x 105개의 B16F10-GP 세포를 CD45.2 C57BL/6J 마우스의 양측 서혜부 영역에 피하(s.c.)로 이식하였다. 7일 후, 이들 종양 보유 마우스에 4mg CTX를 복강내(i.p.)로 주입한 후, 꼬리 정맥 주사(i.v.) 주사를 통해 5 x 105 CD45.1+P14 세포를 입양 이식하였다. 종양이 직경이 약 3-5mm로 자랄 때(P14 세포 전달 후 약 7일), 원발성 종양을 절제하고, PBS 20μL의 5 x 104 B16F10-GP 세포를 편측 서혜부 림프절에 직접 주입하였다. 반대쪽의 서혜부 림프절에는 동일한 양의 PBS가 주입되었습니다. 표시된 시점에서 비전이성 림프절(nLN) 및 전이성 림프절(mLN)의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E, 100x) 염색이 그림 1B에 나와 있습니다. nLN의 구조는 온전했습니다. LN 전이(D8)의 초기 단계에서 mLN은 종양 세포에 부분적으로 점유되어 있었고(검은색 화살표), 종양 세포에 의해 침범되지 않은 림프구가 있는 일부 영역(빨간색 화살표)이 남아 있습니다. LN 전이의 말기(D18)에 있는 동안 mLN은 종양 혈관 신생과 작은 림프구를 동반하는 종양 세포로 채워져 있습니다. TdLN에서 회수된 활성화된 P14 세포는 GP33-41 펩타이드 자극 9,31 후 높은 수준의 IFN-γ를 생성했습니다. 여기에서 활성화된 P14 세포의 비율은 서로 다른 시점에서 유세포 분석을 통해 분석되었으며 게이팅 전략은 그림 2에 나와 있습니다. 초기 단계(D8)와 말기(D18)에서 말초 혈액에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 각각 2.81%와 1.48%입니다(그림 3A). 종양 특이적 CD8+ T 세포는 종양 형성 및 비배출 LN 회수 제한된 기증 세포 동안 dLN에 엄격하게 상주하는 것으로 보고되었다33. nLN에서 항원 특이적 P14 세포의 비율은 LN 전이 동안 안정적이었습니다. 흥미롭게도, mLN의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 nLN에 비해 P14 세포의 빈도가 더 높은 것으로 입증되는 초기 단계에서 일시적으로 증가했지만 후기 단계에서는 급격히 감소했습니다(그림 3B).
그림 1: 실험 설계의 개략도. (A) C57BL/6J 마우스(CD45.2+)를 양측 서혜부 부위에 5 x 105 B16F10-GP 종양 세포를 이식합니다. 7일 후, 이 마우스에 4mg CTX를 복강내로 주입한 후 다음날 선천적으로 표시된 다른 (CD45.1+) P14 세포를 입양 전달했습니다. 종양이 직경이 약 3-5mm로 자라면 (P14 세포 전이 후 약 7일) 원발성 종양을 절제한 후 PBS 20μL의 5 x 104 B16F10-GP 세포를 편측 서혜부 림프절에 직접 주입하고 반대쪽의 서혜부 림프절에 동일한 부피의 PBS를 주입합니다. (B) LN의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E,100x) 염색. 약어: sc = 피하; CTX= 사이클로포스파마이드; i.v. = 정맥 주사; Sac = 희생; nLN = 비전이성 LN; mLN = 전이성 LN. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유세포 분석을 위한 게이팅 전략. 기증자 유래 활성화 항원 특이적 CD8+ T 세포를 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략. 약어: L/D = 살아있는/죽은 자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포의 역학. 서로 다른 시점에서 (A) 말초 혈액, (B) nLN 및 mLN에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 비율. 약어: nLN = 비전이성 LN; mLN = 전이성 LN. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
종양형성 과정에서 항원제시세포(APC)는 종양항원을 삼키고 TdLN으로 이동하여 CD8+ T 세포를 프라이밍합니다. 프라이밍 및 활성화 후, CD8+ T 세포는 TdLN을 떠나 종양에 침투하여 종양 세포를 죽인다10. 림프구에서 면역세포의 출구를 차단하는 TdLN 절제와 FTY720 투여를 통해 여러 연구에서 PD-1/PD-L1 체크포인트 요법의 효능을 보장하는 데 있어 TdLN의 중추적인 역할을 입증했습니다34,35. 이와 일치하게, 우리는 최근에 종양 특이적 기억 CD8+ T 세포(TTSM)가 주로 TdLN에 상주하며, 이 TdLN-TTSM 세포는 ICB9에 대한 선의의 반응자 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 불행히도, 여러 유형의 암세포가 원발성 종양 부위에서 TdLN으로 퍼지는 경우가 많으며, 이는 TdLN의 구조적 재확인 및 면역 세포 기능 장애를 초래합니다. mLN에서 CD8+ T 세포의 손상된 양과 질은 이미 설명되었습니다20,36. 그러나 CD8+ T 세포, 특히 LN 전이성 캐스케이드 동안 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포의 동적 변화는 규명되지 않았습니다.
여기에서 우리는 LN 전이 과정에서 전신 및 국소 항원 특이적 CD8+ T 세포의 역학을 모니터링하기 위한 편리한 마우스 모델을 개발했습니다. B16F10-GP 흑색종 세포를 양측 서혜부 부위에 피하 착상한 후, GP 유래 펩타이드 GP33-41에 의해 특이적으로 활성화될 수 있는 P14 세포로 입양 이식하였다. 세포 이식 후 7일째에 서혜부 LN의 P14 세포가 완전히 활성화되었을 때 양측의 원발성 종양을 절제하고 B16F10-GP 세포를 편측 서혜부 LN에 직접 주입하고, 동일한 용량의 PBS로 주입하여 다른 쪽의 가짜 수술을 수행했습니다. 이 독창적인 설계를 통해 동일한 마우스 내에서 mLN의 P14 세포와 비전이성 LN(nLN)을 비교할 수 있습니다. 동시에, 동일한 마우스 내의 말초 혈액 내 P14 세포는 안와 정맥을 출혈시킴으로써 LN 전이 동안 다른 시점에서 검출되었습니다. 말초 혈액 내 P14 세포의 빈도와 LN 전이 중 여러 단계의 TdLN 외에도 이러한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 전사 및 후성유전학적 특성은 다른 기술로 추가로 검사할 수 있습니다.
참고로 몇 가지 단계는 신중하게 수행해야 합니다. 첫째, 원발성 종양은 잔여 종양 세포가 빠르게 재성장하기 때문에 철저히 절제해야 합니다. 둘째, 종양 조직에는 새로운 혈관이 풍부하게 포함되어 있어 일반적으로 원발성 종양 절제 중에 필연적으로 파열되어 대량 출혈로 인해 수술 쥐가 사망할 수 있으므로 수술은 부드럽게 수행되어야 합니다. 따라서 원발성 종양 절제의 시기가 매우 중요합니다. 일반적으로 종양이 5 x 5mm 정도의 크기로 성장했을 때 제거하는 것이 비교적 안전하며, 종양 세포는 바닥이나 인접 조직이 아닌 LN에 정밀하게 주입해야 합니다. 또한, 종양 세포 현탁액의 부피는 20μL 미만으로 제어되어야 하며, 그렇지 않으면 유출로 인해 LN 외부에 새로운 종양이 형성됩니다. 마지막으로, 이 프로토콜의 한계는 수술이 외상성이며 마우스가 치유 과정에서 감염을 경험할 수 있다는 것이며, 이는 항원 특이적 CD8+ T 세포의 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 수술 중 엄격한 무균을 유지하는 것이 매우 중요하며, 항원 특이적 CD8+ T 세포에 대한 주사로 인한 물리적 손상의 영향을 배제하기 위해 가짜 수술식 PBS 주사를 시행해야 합니다.
전반적으로, 우리는 LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포를 조사할 수 있는 편리한 모델을 제공하며, LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포와 다른 면역 세포 또는 기질 세포 간의 상호 작용도 규명할 수 있습니다. 또한 여러 다른 종양 모델로 쉽게 확장할 수 있습니다. 종합적으로 이 프로토콜은 암 면역학 연구에 유용한 생식 모델을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 우수 젊은 학자를 위한 국가과학재단(82122028호에서 LX로), 중국국가자연과학재단(82173094호에서 LX), 중칭자연과학재단(2023NSCQ-BHX0087호에서 SW로)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
