Summary
Hier presenteren we een protocol om menselijke hersenorganoïden in meerdere rijpingsstadia te enten in het chorioallantoïsche membraan (CAM) van het kuiken. Hersenorganoïden werden gekweekt volgens ongeleide gestandaardiseerde protocollen.
Abstract
Het enten van organoïden in gevasculariseerde weefsels in modeldieren, zoals het immunodeficiënte chorioallantoïsche membraan (CAM) van muizen of kuikenembryo's, is efficiënt gebleken voor neovascularisatiemodellering. De CAM is een rijk gevasculariseerd extraembryonaal membraan, dat een beperkte immunoreactiviteit vertoont, en wordt zo een uitstekend hostingmodel voor celtransplantaties van menselijke oorsprong.
Dit artikel beschrijft de strategie om menselijke hersenorganoïden die in meerdere rijpingsstadia zijn gedifferentieerd, in de CAM te enten. De cellulaire samenstelling van hersenorganoïden verandert met de tijd en weerspiegelt de mijlpalen van de ontwikkeling van het menselijk brein. We entten hersenorganoïden in relevante rijpingsstadia: neuro-epitheliale expansie (18 DIV), vroege neurogenese (60 DIV) en vroege gliogenese (180 DIV) in de CAM van embryonale dag (E)7 kippenembryo's. Geënte hersenorganoïden werden 5 dagen later geoogst en hun histologische kenmerken werden geanalyseerd.
Er werden geen histologische tekenen van neovascularisatie in de getransplanteerde organoïden of abnormale bloedvaten naast de transplantaties gedetecteerd. Bovendien werden opmerkelijke veranderingen waargenomen in de cellulaire samenstelling van de geënte organoïden, namelijk een toename van het aantal gliale fibrillaire zure eiwit-positief-reactieve astrocyten. De cytoarchitecturale veranderingen waren echter afhankelijk van het rijpingsstadium van de organoïde. Al met al suggereren deze resultaten dat hersenorganoïden kunnen groeien in de CAM, en ze vertonen verschillen in de cytoarchitectuur, afhankelijk van hun rijpingsstadium bij het enten.
Introduction
Menselijke hersenorganoïden zijn een opkomende techniek die ons in staat stelt om de vroege ontwikkeling van het menselijk brein in vitro te recapituleren 1,2,3. Desalniettemin is een van de belangrijkste beperkingen van dit model het gebrek aan vascularisatie, dat niet alleen een onmisbare rol speelt bij de homeostase van de hersenen, maar ook bij de ontwikkeling van dehersenen4. Naast de afgifte van zuurstof en voedingsstoffen, suggereert het toenemende bewijs dat het vasculaire systeem van de hersenen neurale differentiatie, migratie en synaptogenese reguleert tijdens de ontwikkeling 5,6. Daarom is er dringend behoefte aan betrouwbare modellen die de ontbrekende vasculaire signalering en structuur aan hersenorganoïden kunnen leveren, waardoor de complexiteit van menselijke hersenorganoïdegeneratie7 wordt vergroot.
Van de voorgestelde methoden voor vascularisatie kunnen twee belangrijke stroomlijnen worden overwogen: organoïde-enting in een levend organisme en puur in-vitrotechnologieën die endotheelcellen en neurale cellen samen kweken 8,9,10,11,12. Intracerebrale transplantatie bij muizen is kostbaar en tijdrovend, waardoor andere technologieën relevant zijn voor eenvoudigere modellen. De kuikenchorioallantoïsche membraan (CAM)-test is uitgebreid gebruikt om angiogenese 13,14,15 te bestuderen. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen met succes verschillende soorten organoïden, waaronder nier16,17, cardiale18 en tumororganoïden19,20, in CAM's geënt. Toch is er weinig bekend over de werkzaamheid, toxiciteit/afstoting, fysiologisch effect en methoden om menselijke hersenorganoïden in de CAM te enten. Een ander interessant en nog onontgonnen aspect is de vorming van een chimere bloed-hersenbarrière (BBB) tussen de CAM en de organoïde astrocytaire interface. Eerder baanbrekend werk suggereerde de vermeende haalbaarheid van het genereren van een BBB in de CAM door astrocyten en astrocyt-geconditioneerd medium 21,22,23 te transplanteren. Volwassen astrocyten lijken echter niet in staat te zijn om deze 24,25 te bereiken. De door astrocyten geïnduceerde vorming van de BBB blijft dus discutabel, en het transplanteren van menselijke hersenorganoïden zou ons in staat stellen licht te werpen op deze controverse.
Dit video-artikel beschrijft een protocol voor een in ovo menselijke hersenorganoïdetransplantatie in CAM die groei, verbetering en vascularisatie bevordert, wat resulteert in organoïden die histologisch compatibele BBB-elementen bevatten. Hier presenteren we een protocol dat de overleving van het kippenembryo garandeert en rapporteren we over de toelaatbaarheid van de CAM om de groei van hersenorganoïden te ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De embryo's van de White Leghorn-kip (Gallus gallus) werden behandeld door de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van het Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, VS, te volgen, en de experimenten werden goedgekeurd door de Council for Care and Use of Experimental Animals van de Universiteit van Barcelona.
1. Niet-geleide voorbereiding van hersenorganoïden
- Handhaaf H9 menselijke embryonale stamcellen (hESC's) in mTESR1 voorverwarmd bij kamertemperatuur (RT) onder een confluentie van 70% in platen met 6 putjes bedekt met Matrigel opgelost in DMEM (1:40) in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C.
OPMERKING: Matrigel moet in ijs worden bewaard totdat het als coating wordt gebruikt om polymerisatie te voorkomen. - Genereer hersenorganoïden volgens het ongeleide hersenprotocol 2.
- Dissocieer H9 hESC's met 500 μL van de celdissociatieoplossing en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C. Resuspendeer in mTESR1 met een ROCK-remmer Y27632 (eindconcentratie 50 μM) en zaad 9.000 cellen per putje in een voorbehandelde plaat met lage hechting van 96 putjes.
- Zodra de organoïden zich hebben geaggregeerd in mTESR1 met een ROCK-remmer Y27632 (eindconcentratie 50 μM), breng je ze gedurende 5-6 dagen over in inductiemedium.
- Volg ongeleid hersenorganoïdeprotocol26 en breng de organoïden over naar neurale inductiemedia op ~ dag 4-5.
- Zodra ze de grootte en de neuro-epitheelring hebben bereikt, breng je ze over in een ijskoude Matrigel-druppel. Zodra de Matrigel is gepolymeriseerd, brengt u de organoïden over in een petrischaal van 5 cm met een lage hechting en 5 ml voorverwarmd rijpingsmedium.
- Breng na 4 dagen de hersenorganoïden in beweging in de orbitale beweging.
- Verzamel de organoïden voor de oogst in verse DPBS vlak voor het enten.
2. Onderhoud van eieren, activering van de ontwikkeling en punctie van de eierschaal
- Bewaar bevruchte eicellen (op dag 0) in een broedmachine bij 18 °C tot gebruik.
OPMERKING: Bij deze temperatuur ontwikkelen ze zich niet en blijven ze in hetzelfde rijpingsstadium. - Indien nodig voor gebruik, incubeer ze bij 38 °C en 60% relatieve vochtigheid met zachte schommelrotatie onder een hoek van 45 °C.
- Reinig op dag 1 het oppervlak van de eierschaal met 70% ethanol en droog het af met keukenpapier om het te steriliseren.
- Plaats een zelfklevend verband van chirurgisch papier, hierna "verband" genoemd, bovenop het ei en bedek de luchtkamer van het ei.
NOTITIE: Dit voorkomt dat stof van de eierschaal in de CAM valt waar het vast komt te zitten. - Voer de perforatiepunctie van de luchtkamer, hierna aangeduid als luchtkamergat (ACH), uit met een steriele naald 21 G x 11/2'', waarbij u de eierschaal zachtjes doorboort. Open de ACH op de bovenste punt van het ei om te voorkomen dat de CAM wordt verstoord, die op dit punt gescheiden van de schaal ligt.
- Om de beste positie te vinden om de ACH te doorboren, gebruikt u een lamp om het dunste eierschaaloppervlak aan de bovenste punt van het ei te bepalen. De directe lichtstraaltransmissie geeft de beste positie aan om te boren.
- Bedek de ACH met een nieuw verband om het embryo te beschermen tegen de externe omgeving en plaats het ei terug in de broedmachine.
- Stop vanaf dit moment met draaien in de broedmachine en houd de eieren in verticale positie met het venster bovenop.
OPMERKING: Dit zal de ontwikkeling van het embryo vergemakkelijken en de CAM komt bovenaan beschikbaar met een luchtkamer tussen het embryo en de eierschaal, waardoor latere enting mogelijk is. - Open de ACH van dag 1 tot dag 4. De levensvatbaarheid neemt toe op dag 4 (3 dagen voorafgaand aan de entdag).
3. Transplantatie van hersenorganoïden
- Voer transplantatie uit op dag 7 wanneer de CAM goed ontwikkeld en gevasculariseerd is, waarbij het ei over het hele embryo wordt bedekt.
- Verwijder het verband en veeg het oppervlak van de eierschaal af met 70% ethanol om de eierschaal te steriliseren, voordat u de ACH voorzichtig verbreedt in een entvenster.
- Plaats een nieuw, groter verband dat de verlenging bedekt voorbij het laatste entvenster om te voorkomen dat fragmenten van de eierschaal in de CAM vallen terwijl het entvenster wordt vergroot.
OPMERKING: Dit grotere venster is nodig om de beste entpositie te selecteren en voor de daaropvolgende enting. - Vergroot het entvenster door de eierschaal zachtjes aan te prikken totdat het venster een diameter van ongeveer 2 cm heeft bereikt. Verwijder voorzichtig de randen van het eierschaalvenster met een pincet totdat het venster vergroot is. Verwijder het resterende stof en de stukjes eierschaal die aan het verband blijven zitten door het verband voorzichtig los te trekken.
- Plaats de organoïde met een P200 automatische pipet. Knip de uiteinden af met een steriele en scherpe schaar om de opening te vergroten overeenkomstig de grootte van de organoïde en schade aan de organoïde te voorkomen of gebruik steriele tips met brede dikte. Verzamel de organoïde in een maximaal volume van 50 μL PBS en breng deze rechtstreeks over in de CAM, aan een kant tegenover de locatie van het embryo.
- Zorg ervoor dat de positie van het transplantaat ver van de dooier verwijderd is om te voorkomen dat het tijdens het oogsten scheurt, en plaats het bij voorkeur in de buurt van een bloedvat.
- Plaats een druppel van 7 μL Matrigel rond de organoïde nadat u de organoïde op de CAM hebt geplaatst.
OPMERKING: Dit voorkomt dat de organoïde over het membraan beweegt. - Sluit het venster met een klein stukje parafilm dat precies op de maat van het raam past en bevestig het met een zelfklevend verband aan de schaal.
NOTITIE: Het is belangrijk om het raam volledig af te dekken met de parafilm om te voorkomen dat het embryo uitdroogt en tegelijkertijd gasuitwisseling mogelijk maakt. Beperk de uitbreiding van de raambedekking op de juiste manier en vermijd overschrijding van het venster, aangezien dit de noodzakelijke gasuitwisseling voor een correcte embryonale ontwikkeling zou kunnen belemmeren27.
4. Getransplanteerde organoïden oogsten
- Oogst de geënte organoïden en de omringende CAM op dag 12 van de ontwikkeling van de kip, overeenkomend met 38 Hamburger- en Hamilton-ontwikkelingsstadium (HH38)28, 5 dagen na het enten. In dit stadium is de CAM volledig gedifferentieerd met volwassen vasculatuur, terwijl de veerkiemen zowel de vleugels als het bovenste ooglid van het embryo bedekken.
- Vergroot na het verwijderen van het zelfklevende verband het venster verder om het oogsten van monsters te vergemakkelijken met een schaar en een fijn pincet.
- Visualiseer de organoïde indien nodig met behulp van een binoculaire dissectiemicroscopie, gevolgd door een prefixatiestap van 2 minuten met 4% paraformaldehyde (PFA) om het oogsten van organoïden en CAM te helpen.
- Verzamel een 1,5 cm2 deel van de CAM met de organoïde.
- Sample fixatie
- Was de monsters met 1x PBS en fixeer ze met 4% PFA (in PBS, pH 7,2) gedurende 30 minuten bij 4 °C. Was de monsters vervolgens 3 x 5 minuten in PBS.
- Bewaar de monsters bij 4 °C in PBS met natriumazide of cryoprotecteer ze direct in 30% sucrose-PBS 's nachts bij 4 °C.
- Na cryoprotectie worden de monsters ingebed in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) en worden ze opgeslagen bij -20 °C tot ze worden gesneden. Snijd plakjes weefsel van 20 μm dik met behulp van een cryostaat en verzamel ze op xylanized glaasjes. Bewaar de objectglaasjes bij -20 °C totdat ze worden gebruikt om te kleuren.
5. Immunofluorescentie
- Verwijder OCT. uit de secties met een PBS-oplossing met 0,1% Triton X-100 (PBS-T) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Behandel de coupes met een blokkerende oplossing (BS) met een 2% BSA, 3% ezelserum PBS-T 0,01% oplossing gedurende 1 uur bij RT.
- Verdun het geselecteerde primaire antilichaam (zie de materiaaltabel) in BS en incubeer de monsters 's nachts bij 4 °C.
- Was de volgende dag de monsters 3 x 10 min in 1x PBS bij RT.
- Verdun het secundaire antilichaam in BS en incubeer gedurende 2 uur bij RT (zie de materiaaltabel).
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) om de celkernen te markeren bij RT, verdund in PBS-T in een verdunning van 1:1,000.
- Monteer de geleiders met montagemedium en dek ze af met glazen dekglaasjes.
- Maak alle foto's met een breedveld fluorescentiemicroscoop op 2,5, 10, 20 en 40x.
- Bewaar de plakken bij 4 °C.
6. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring
OPMERKING: Om te bewijzen dat de transplantatie heeft gewerkt, voert u H&E-kleuring uit.
- Verwijder OCT met PBS-T 0.1% gedurende 10 minuten bij RT.
- Voer seriële dehydratatie in een kap als volgt uit: 10 min in gedestilleerd water (DW), 45 s in hematoxyline, 1 min in DW, 20 s in PBS, 2 x 30 s in 70% EtOH, 2 x 30 s in 80% EtOH, 2 x 30 s in 96% EtOH, 30 s in eosine, 2 x 15 s in 96% EtOH, 2 x 15 s in 100% EtOH, 1 min in xylol-100% ETOH, 1 min in xylol, 1 min in xylol (vers).
- Monteer de glazen dekglaasjes met een montagemedium op xyleenbasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het rijpingsschema van het embryo voor de transplantatie selecteren
Het experiment begint bij D0 wanneer bevruchte eieren worden uitgebroed bij 38 °C en een relatieve vochtigheid van 60%. Het chorioallantoïsche membraan (CAM) is een sterk gevasculariseerd extraembryonaal membraan dat zich ontwikkelt na het uitbroeden van eieren. Het wordt gevormd door de fusie van de allantois en chorion. Bij D1, na 24 uur incubatie, wordt de luchtkamer doorboord om te voorkomen dat de CAM zich hecht aan het binnenste schaalmembraan. Het doorprikken van de luchtkamer bij D1 verbetert de kwaliteit van de luchtkamer in vergelijking met punctie in latere stadia (D4). De CAM blijft groeien tot D12, wanneer het de volledige ei-inhoud omhult en zich stevig hecht aan het binnenste schaalmembraan (Figuur 1). Het gat dat bij D7 is gemaakt, is vergroot om het oogsten van monsters te vergemakkelijken. D7 is het optimale moment voor transplantatie wanneer de CAM volwassen is en de dooierzak en het embryooppervlak bedekt. In dit stadium wordt het gat in de luchtkamer vergroot en worden de organoïden met behulp van een automatische pipet in de CAM overgebracht.
Hersenen organoïde transplantatie
Tijdens de inherente rijping van hersenorganoïden in vitro verandert hun cellulaire samenstelling van neurale voorlopercellen naar volwassen neuronen en gliacellen. Neurovasculatuur en neurogenese zijn vermengde en onderling afhankelijke ontwikkelingsprocessen bij gewervelde dieren, en de signalering die tot deze overspraak leidt, is sterk afhankelijk van het rijpingsstadium van de neurale tegenhanger29. Neurale voorlopercellen zijn de belangrijkste bron van proangiogene factoren in de zich ontwikkelende hersenen 29,30. Integendeel, neuronen en astrocyten ondersteunen neoangiogenese in volwassen stadia en volwassenheid door de afscheiding van vasculaire endotheliale groeifactor 31,32. Deze veranderingen in de cytoarchitectuur van de hersenen, die ook worden weerspiegeld in hersenorganoïden, kunnen leiden tot differentiële veranderingen in de integratie en respons op CAM-ententie, afhankelijk van het rijpingsstadium van hersenorganoïden. Daarom hebben we hersenorganoïden geënt op differentiatiedag 13 in vitro (DIV), wanneer neuro-epitheelcellen en radiale glia uitzetten; bij DIV 37, bij het begin van neurogenese; bij DIV 60, wanneer de neurogenese robuust is en neuronen van verschillende identiteiten terminaal gedifferentieerd zijn; en bij DIV 120, wanneer een overvloed aan volwassen neuronen de organoïde bevolkt, wordt een goed ontwikkeld neuronaal netwerk gegenereerd en is astrogenese ook wijdverbreid.
In alle gevallen werden de monsters verzameld na 5 dagen incubatie in ovo (DIO). Om vertekeningen als gevolg van batch-effect in hersenorganoïden te voorkomen, werden alle vergelijkingen tussen getransplanteerde en niet-getransplanteerde organoïden paarsgewijs in dezelfde batch uitgevoerd. Organoïden werden afgeleid van ten minste twee onafhankelijke experimenten per tijdspunt en in totaal zes onafhankelijke differentiaties. Het enten van meerdere rijpingsstadia werd parallel uitgevoerd in elk entexperiment. Na het enten zetten organoïden het rijpingsproces naast de CAM-vaten voort zonder enig bewijs van infiltratie van bloedvaten in de organoïde (Figuur 2).
De overleving van organoïden bij transplantatie varieert van 80% bij de jongste en daalt tot ~66% bij volwassen organoïden na 5 dagen na enten, wat suggereert dat de permissiviteit en de plasticiteit van organoïdentransplantatie in de loop van de tijd kunnen veranderen (tabel 1). De levensvatbaarheid van de organoïden werd bepaald door de aanwezigheid van pyknotische kernen in H&E-kleuringen. Het aantal pyknotische kernen was vergelijkbaar tussen getransplanteerde en niet-getransplanteerde controleorganoïden (Figuur 3), wat suggereert dat CAM tolerant is om de levende organoïde bij transplantatie in stand te houden. Bovendien werd er geen histologische of hemogene afgifte gedetecteerd bij de CAM en blijven de embryo's in leven, wat suggereert dat noch de transplantatieprocedure, noch de organoïde de integriteit van de CAM verstoren of de ontwikkeling van het embryo significant beïnvloeden.
Celsamenstelling in getransplanteerde hersenorganoïden
Ongeleide hersenorganoïden hebben een duidelijke inter- en intra-organoïde cellulaire variabiliteit. Ze zijn echter overwegend neuraal en genereren golven van voorlopers, neuronen en astrocyten in een sequentieel tempo 2,26. Vervolgens evalueerden we of enten de neurale samenstelling in de hersenorganoïden verandert. Jongere organoïden (13 DIV + 5 DIO: 18 dagen) vertonen geen verschillen met hun niet-geënte organoïden in aanwezigheid van neuronen (TUBB3+). In latere rijpingsstadia (60 DIV +5 DIO: 65 dagen en 120 DIV + 5 DIO: 125 dagen) is het aandeel neuronen (TUBB3+) dramatisch afgenomen in vergelijking met dat in niet-geënte organoïden (Figuur 4). In niet-geënte organoïden die 60 DIV hebben gerijpt, zijn neuronen wijd verspreid over de organoïden.
Met name het aantal en de lokalisatie van gliale fibrillaire zure eiwitpositieve (GFAP+) astrocyten vertoonde een toename in vergelijking met die waargenomen bij de niet-geënte controles. Bovendien kregen deze GFAP+ astrocyten een onverwachte lokalisatie in de buitenzijde van de organoïde. In 18 DIV, vrije organoïden (niet-geënt) zijn weinig astrocyten te zien en kon geen structurele verspreiding worden gedetecteerd; integendeel, ze lijken homogeen verspreid over de organoïde (Figuur 3).
Figuur 1: Tijdlijn van de CAM-assay voor organoïdetransplantatie. (A) Chirurgisch papier zelfklevend verband aanbrengen bovenop het ei. (B) Maak een gat in de schaal met een naald over het zelfklevende verband. (C) Open het raam van de eierschaal, zicht van bovenaf, klaar voor de transplantatie van een (D) menselijke hersenorganoïde (dag 60). Schaalbalk = 100 μm. (E) Visualisatie van de geënte organoïde in de CAM na 5 dagen in-ovo-incubatie . (F) Kenmerken van de ontwikkeling van hersenorganoïden van dag 0 tot dag 120. De pijl geeft de locatie van de organoïde aan. Afkorting: CAM = chorioallantoïsch membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hematoxyline- en eosinekleuring van geënte organoïden in het chorioallantoïsche membraan. (A) 13 DIV + 5 DIO organoïde; b) 37 DIV + 5 DIO organoïde; c) 60 DIV + 5 DIO organoïde; en (D) 120 DIV + 5 DIO organoïde; Rode vierkanten markeren de organoïde. Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: DIV = dag in vitro; DIO = dag in ovo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunocytochemie van organoïden in verschillende stadia van ontwikkeling. GFAP werd gebruikt voor kleuring en DAPI voor de kernen. Schaalbalk = 100 μm. (A,B) Afbeeldingen van dezelfde 13 DIV + 5 DIO geënte organoïde waarbij astrocyten te zien zijn rond de rand van de organoïde. (C) Afbeelding van 18 DIV-vrije organoïden waarbij astrocyten nauwelijks zichtbaar zijn. Het verschil tussen vrije en geënte organoïden is zeer merkbaar. (D,E) Afbeeldingen van 37 DIV + 5 DIO geënte organoïden waar weinig astrocyten te zien zijn. (F) Afbeelding van 42 DIV-vrije organoïde. Gele pijlen geven de locatie van de astrocyten aan. Afkortingen: DIV = dag in vitro; DIO = dag in ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunocytochemie van 120 DIV-organoïden. TUBB3 werd gebruikt voor het kleuren van de neuronen en DAPI voor de kernen. Schaalbalk = 100 μm; foto's zijn gemaakt op 20x. (A) Een 120 DIV +5 DIO geënte organoïde waar weinig neuronen te zien zijn. (B) Een 125 DIV, vrije organoïde met veel neuronen. Het sterretje geeft de locatie van de organoïde aan, terwijl de stippellijn de grens tussen de organoïde en de CAM aangeeft (bepaald door histologische analyse). Afkortingen: DIV = dag in vitro; DIO = dag in ovo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; CAM = chorioallantoïsch membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Organoïden | 13 DIV | 37 DIV | 60 DIV | 120 DIV |
| Levend | 6 (75%) | 10 (83%) | 6 (66%) | 6 (66%) |
| Dood | 2 (25%) | 2 (16%) | 3 (34%) | 3 (34%) |
Tabel 1: Embryonale overlevingspercentages na CAM-organoïdentransplantatie. Afkortingen: DIV = dag in vitro; DIO = dag in ovo; CAM = chorioallantoïsch membraan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschrijven we een gedetailleerd protocol met tal van belangrijke stappen die zorgen voor een gunstige groei en ontwikkeling van menselijke hersenorganoïden bij transplantatie zonder de overleving van de kippenembryo's te verstoren. We adviseerden het gebruik van steriele naalden om de luchtkamer van het ei te doorboren na 24 uur incubatie (dag 1). Daarnaast probeerden we ook de punctie op dag 4 te maken (na het controleren van de eierschaal met licht om de ontwikkeling van het vaatstelsel te testen om er zeker van te zijn dat we alleen met gezonde embryo's werkten). Dit resulteerde echter in een afname van de levensvatbaarheid van het embryo als gevolg van de nabijheid van de CAM-vaten tot de eierschaal. Opgemerkt moet worden dat het uitoefenen van te veel kracht kan leiden tot het breken van de eierschaal met de daaropvolgende schade aan de CAM-vasculatuur. Het gebruik van een lichtbron om uitgedunde delen van de eierschaal te detecteren, was nuttig voor het maken van stompe gaten en tegelijkertijd het voorkomen van overpenetratie en het passeren van het ei, wat leidde tot invasie van de CAM.
Hoewel eirotatie verplicht lijkt voor de goede ontwikkeling van de kippenembryo's tijdens het broeden, is het noodzakelijk om dit te vermijden na het doorboren van de luchtkamer. Verwijdering van albumine was niet gerechtvaardigd voor dit model, evenmin als de toevoeging van PBS om uitdroging van het ei te voorkomen. Bovendien moet het gebruik van 70% ethanoloplossing verstandig worden gedaan, met extra zorg om de resterende ethanoloplossing op de schaal te drogen om de embryonale levensvatbaarheid te behouden. Een ander kritiek punt is de grootte van het eierschaalgat dat voor de implantatie wordt gebruikt, waarvoor het kleinst mogelijke gat moet worden gebalanceerd dat het comfort van de transplantatiemanipulatie mogelijk maakt. De selectie van het embryonale stadium voor transplantaties (E7) werd gedreven door het rijpingsstadium van de CAM en de relatieve grootte ervan, wat de integratie van de transplantatie bevorderde. In het geval dat de getransplanteerde organoïden echter langer ovo-rijping nodig hebben, kan de transplantatie worden uitgevoerd op dag E5.5/6. De variabiliteit van hersenorganoïden wordt gecontroleerd om de experimentele levensvatbaarheid te garanderen. Organoïden van dezelfde leeftijd vertonen vergelijkbare groottes en het is belangrijk op te merken dat, ongeacht de leeftijd van de organoïden, ze allemaal 5 dagen na transplantatie zijn geïncubeerd. Bovendien werden de controleorganoïden voor consistentie zorgvuldig gekozen om overeen te komen met de exacte grootte van hun geënte tegenhangers. Een ander technisch aspect, relevant voor het ondersteunen van de overleving van zowel de geënte organoïden als het embryo, is het dichten van het transplantaatgat met een vierkant stuk parafilm, om een gecontroleerde in ovo-omgeving te behouden.
In tegenstelling tot onze aanvankelijke hypothesen, overleefden jonge organoïden beter na het entproces en CAM-integratie dan de oudere. We veronderstelden dat jongere organoïden plastischer zijn vanwege hun verrijkte aanwezigheid in voorlopers in een vroeg stadium33, terwijl volwassen neuronen een tolerante neuronale omgeving nodig hebben voor hun onderhoud. Bovendien werden cytoarchitecturale veranderingen in de vroege (D18) hersenorganoïdentransplantaties gedetecteerd in de distributie van astrocyten. We ontdekten met name dat astrocyten in dit vroege stadium alleen differentieerden wanneer ze werden geënt en dat ze zichzelf verspreidden om een pseudo-capsule onder het organoïde-oppervlak te genereren. Deze structuur zou een herinnering kunnen zijn aan het potentieel van de organoïde om een neurovasculaire interface te genereren die de BBB zou kunnen nabootsen. Als alternatief zou de verhoogde reactiviteit van astrocyten, gepositioneerd in een barrière-achtige structuur, een indicatie kunnen zijn van een immunogene respons van de organoïde op uitgescheiden signalering van de CAM. Er is echter verder werk nodig om deze hypothese aan te tonen. Samenvattend beschrijft dit artikel de stappen om organoïden van meerdere ontwikkelingsstadia in de kippen-CAM te enten, wat een meer tolerante situatie is voor organoïden in vroege ontwikkeling, en het cellulaire effect van deze transplantatie in neuronen en GFAP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We danken Dr. Alcántara en Dr. Ortega van UB en de rest van de leden in het laboratorium van Dr. Acosta voor de inzichtelijke discussies. S.A. is Serra-Hunter collega-assistent-professor van de Generalitat de Catalunya aan de Universitat de Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I.
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al.
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C.
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
