מיון חד-תאי של תאי גזע מזנכימליים אימונופנוטיפיים משיניים נשירות שעברו קילוף אנושי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים בשיטת המיון של תא יחיד. באופן ספציפי, השימוש במיון תא בודד יכול להשיג טוהר של 99% של התאים האימונופנוטיפיים מאוכלוסייה הטרוגנית בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריית זרימה מולטי-פרמטרית.
Abstract
תאי הגזע המזנכימליים (MSCs) של אורגניזם הם בעלי יכולת יוצאת דופן להתמיין לשושלות מרובות של תאים בוגרים בגוף וידועים בתכונותיהם האימונומודולטוריות והאנטי דלקתיות. השימוש בתאי גזע אלה הוא ברכה לתחום הביולוגיה הרגנרטיבית, אך בה בעת, פגע ברפואה רגנרטיבית ובטיפולים בשל העמימות התאית המרובים הקשורים אליהם. עמימות זו עשויה לנבוע מהמגוון במקור של תאי גזע אלה ומתנאי הגידול שלהם במבחנה , שניהם משקפים את ההטרוגניות התפקודית שלהם.
זה מצדיק מתודולוגיות לספק אוכלוסיות מטוהרות והומוגניות של MSCs ליישומים טיפוליים. ההתקדמות בתחום ציטומטריית הזרימה אפשרה זיהוי אוכלוסיות חד-תאיות בגישה רב-פרמטרית. פרוטוקול זה מתווה דרך לזהות ולטהר תאי גזע משיני נשירים אנושיים (SHEDs) באמצעות מיון חד-תאי בסיוע פלואורסצנטי. ביטוי סימולטני של סמנים על פני השטח, כלומר, CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC), CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC), ו- CD44-V450, זיהה את הביטויים החיוביים “הבהירים” של MSCs באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית. עם זאת, נצפתה ירידה משמעותית באחוזים של מבטאים מרובעים של סמנים חיוביים אלה מקטע 7 ואילך לקטעים המאוחרים יותר.
תת-האוכלוסיות האימונופנוטיפיות מוינו באמצעות מצב מיון של תא בודד, שבו רק שני סמן חיובי וסמן שלילי אחד היוו את קריטריוני ההכללה. מתודולוגיה זו הבטיחה את יכולת הקיום של התאים של האוכלוסיות הממוינות ושמרה על התפשטות תאים לאחר המיון. היישום במורד הזרם עבור מיון כזה יכול לשמש להערכת הבחנה ספציפית לשושלת עבור תת-אוכלוסיות מגודרות. גישה זו יכולה להיות מיושמת במערכות חד-תאיות אחרות כדי לשפר את תנאי הבידוד ולהשיג מידע על סמנים מרובים של פני התא.
Introduction
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים להיחשב כמקור מדרגי של תאים המתאימים לטיפולים מבוססי תאים ועשויים להיחשב למערכת תקן זהב ברפואה רגנרטיבית. תאים אלה יכולים להיות מבודדים ממגוון מקורות בגוף עם מקורות רקמה שונים1. בהתאם לרקמת המקור שלהם, כל סוג של MSC מציג התנהגות חוץ גופית מעורפלת2. זה נצפה היטב בתכונות המורפולוגיות והפונקציונליות שלהם3. מחקרים רבים הראו שונות תוך-שבטית במימדים, כולל התמיינות רקמות בוגרות, מצב גנומי וארכיטקטורה מטבולית ותאית של MSCs 2,4.
אימונופנוטיפ של תאים היה יישום נפוץ של ציטומטריית זרימה לזיהוי תאי גזע וזה נוצל על ידי האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית וגנטית (ISCT) בשנת 2006 כדי לקבוע רשימה של קריטריונים מינימליים לזיהוי תאים כ- MSC. הוא קבע כי יחד עם היצמדות פלסטית והיכולת להתמיין לשלוש שושלות (אוסטאוגנית, כונדרוגנית ואדיפוגנית) במבחנה, ≥95% מאוכלוסיית התאים חייבת לבטא CD105, CD73, CD90, ותאים אלה חייבים להיות חסרים את הביטוי (≤2% חיובי) של CD34, CD45, CD11b, CD14 ו- HLA-DR, כפי שנמדד על ידי ציטומטריית זרימה5. אף על פי שה-MSCs הוגדרו על ידי קבוצה של סמנים ביולוגיים תחת הקריטריונים המינימליים של ISCT, לא ניתן היה למדוד את התכונות החיסוניות שלהם עם סמנים ביולוגיים אלה והיה צורך ביותר מעבר לקריטריונים אלה כדי להקל על השוואות צולבות ושינויים שבטיים לכימות2.
למרות ההנחיות שנקבעו על ידי ISCT, מחקר מקיף על MSCs הראה כי הטרוגניות קיימת באוכלוסייה זו, אשר יכולה לנבוע ממספר רב של גורמים, בעיקר בשל האופי הנפוץ של הטרוגניות המתעוררת בין תורמי MSC6, מקורות רקמות7, תאים בודדים בתוך אוכלוסיית שבטים8, ותנאי תרבית2,9, 10. אפיון וטיהור של תאים ראשוניים אלה ממגוון מקורות רקמה כדי להבטיח איכות וגורל התא הם שלבי מפתח בייצורם. הצורך להבין את השונות המוצגת באוכלוסייה מחייב שיטה יעילה כדי לפתור אותה לתת-אוכלוסיות שניתן לחלק ולאסוף בנפרד11. אנליזות ברמת התא הבודד מסייעות להתגבר על האתגרים של שונות תא-תא, להפחית רעש ביולוגי הנובע מאוכלוסייה הטרוגנית, ולהציע את היכולת לחקור ולאפיין תאים נדירים12.
בהתאם למטרה ולפרמטרים שנבחרו, ניתן להשתמש במספר שיטות כדי למיין ולהעשיר את האוכלוסיות שנבחרו. טכניקות מיון תאים יכולות לכלול הן מיון בתפזורת והן שיטות מיון של תא יחיד. בעוד שמיון בתפזורת יכול להעשיר אוכלוסיות יעד באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS)13, שבר 14 ואלוטריציה 15, מיון תא בודד יכול להעשיר אוכלוסיות הומוגניות יותר באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)11. ניתוח השוואתי של כל אחת משיטות אלה עם מערך יתרונות וחסרונות משלה מודגש בטבלה 1.
טבלה 1: ניתוחים השוואתיים של טכניקות שונות: MACS, Fractionation, Elutriation ו-FACS המדגישים את ההבדלים בעיקרון שלהם ואת היתרונות והחסרונות של בחירת טכניקה מסוימת על פני אחרת. קיצורים: MACS = מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
מאז הופעת הטכניקה, ציטומטריית זרימה של תא בודד מילאה תפקיד מרכזי בספירה16, גילוי ואפיון של אוכלוסיית תאים ספציפית במדגם הטרוגני17. יואיט ועמיתיו הניחו בשנת 2006 את הבסיס למתודולוגיית מיון תאים אוטומטית כדי לשפר את הבידוד של מאגרים הומוגניים של תאי גזע עובריים אנושיים ממוינים (hESCs)18. מיון חד-תאי העשיר את אוכלוסיית תאי גזע עוברי גזע עוברי GFP והקל על בידוד שיבוטים מהונדסים גנטית, מה שפתח ממד חדש במחקר הקליני. כדי לשפר את יעילות המיון, ננקטו בדרך כלל שתי גישות; או שמדיית האיסוף של האוכלוסיות הממוינות משתנה כדי לקיים את הקיום וההתרבות של תאים לאחר מיון19 או שהאלגוריתם/התוכנה למיון תאים משתנים כראוי12.
עם התקדמות הטכנולוגיה, ציטומטרים מסחריים של זרימה וממייני תאים הצליחו לסייע בהתמודדות עם אתגרים שנענו תוך מיון אספטי של אוכלוסיות תאים שבריריות ונדירות, במיוחד תאי גזע ממקורות שונים. אחד האתגרים העיקריים של ביולוגים של תאי גזע היה בידוד השבט של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בעקבות פרוטוקולי טרנספקציה הנדרשים במחקרי עריכת גנים19. זה טופל על ידי מיון תאים בודדים ללוחות של 96 בארות שצופו בפיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) יחד עם תוספי מזון ומעכבי ROCK מסחריים של מולקולות קטנות. עם זאת, אסטרטגיות בידוד תאים יכולות להיות מעודנות במידה רבה באמצעות שימוש במיון אינדקסים, תכונה של אלגוריתם המיון המזהה את האימונופנוטיפ של תאים בודדים ממוינים12. שיטה מעודנת זו במיון תאים בודדים סייעה לא רק בשיפור יעילות המיון של תאי גזע, במיוחד ביחס לאוכלוסיות נדירות של תאי גזע המטופויטיים, אלא גם קישרה ביעילות שיבוטים של תאים בודדים למבחני התפקוד שלהם במורד הזרם20.
מאמר זה מתמקד במיון חד-תאי של תאי גזע אימונופנוטיפיים משיניים נשירות מתקלפות אנושיות (SHEDs) להעשרת תת-אוכלוסיות כדי לחקור את יכולות ההתמיינות התפקודית שלהן. באמצעות שילוב של שני סמנים חיוביים ל-MSC, CD90 ו-CD73, וסמן המטופויטי שלילי CD45, ה-MSCs עברו אימונופנוטיפ וזוהו המבטאים העמומים והאפסיים. בהתבסס על האימונופנוטיפ שלהם, תת-האוכלוסיות זוהו כ-MSCs טהורים, אוכלוסיות חיוביות בודדות ושליליות כפולות. הם מוינו באמצעות מצב מיון של תא בודד כדי לקבל תת-אוכלוסיות טהורות ומועשרות למחקרים פונקציונליים נוספים כדי לזהות אם הביטוי הדיפרנציאלי של סמנים היה תוצר של תנאי תרבית חוץ גופית או אם יש לו השפעה כלשהי גם על התכונות הפונקציונליות. תאים שלא היו מבטאים הומוגניים של “סמני MSC חיוביים” מוינו כדי לחקור את התכונות התפקודיות שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בתחום הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, בין המקורות שלאחר הלידה, MSCs שמקורם ברקמת הפה משכו עניין רב בגלל מחויבויותיהם האתיות המינימליות ופוטנציאל התמיינות רב-שושלתי בולט21. תאי גזע של מוך השן (DPSCs) מהטוחנת השלישית שנפגעה זכו לתשומת הלב הרבה ביותר בקרב MSCs דנטליים בשל הפוטנציאל הטיפו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן תאי הזרימה במרכז ג’וואהרלל נהרו למחקר מדעי מתקדם, בנגלור, הודו, על השימוש במתקן ליבת ציטומטריית הזרימה. החתך הקריו-חתך של תרבית הכדוריות של תאים ממוינים בוצע במעבדת הייחוס של נויברג אנאנד, בנגלור, הודו. עבודה זו נתמכה על ידי מימון פנימי של UC מהאקדמיה להשכלה גבוהה Manipal (MAHE), הודו. AG אסירת תודה על תמיכתה במלגת ד”ר T. M. A. Pai מ- MAHE.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
Riferimenti
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112 (2019).
- Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
- McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
- Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
- Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
- Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
- Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
- Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11 (2019).
- Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405 (2020).
- Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
- Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
- . . FACSAria Fusion User’s Guide. , (2018).
