Este protocolo describe el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia de células madre mesenquimales humanas utilizando el método de clasificación de una sola célula. Específicamente, el uso de la clasificación de una sola célula puede lograr una pureza del 99% de las células inmunofenotipadas de una población heterogénea cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica.
Las células madre mesenquimales (MSC) de un organismo poseen una extraordinaria capacidad para diferenciarse en múltiples linajes de células adultas en el cuerpo y son conocidas por sus propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias. El uso de estas células madre es una bendición para el campo de la biología regenerativa, pero al mismo tiempo, una pesadilla para la medicina regenerativa y la terapéutica debido a las múltiples ambigüedades celulares asociadas con ellas. Estas ambigüedades pueden surgir de la diversidad en la fuente de estas células madre y de sus condiciones de crecimiento in vitro , las cuales reflejan su heterogeneidad funcional.
Esto justifica metodologías para proporcionar poblaciones purificadas y homogéneas de MSC para aplicaciones terapéuticas. Los avances en el campo de la citometría de flujo han permitido la detección de poblaciones unicelulares mediante un enfoque multiparamétrico. Este protocolo describe una forma de identificar y purificar las células madre de los dientes deciduos exfoliados humanos (SHED) a través de la clasificación de células individuales asistida por fluorescencia. La expresión simultánea de marcadores de superficie, a saber, el isotiocianato de fluoresceína CD90 (FITC), la proteína CD73-peridinina-clorofila (PerCP-Cy5.5), la aloficocianina CD105 (APC) y la CD44-V450, identificó los expresores positivos “brillantes” de las MSC mediante citometría de flujo multiparamétrica. Sin embargo, se observó una disminución significativa en los porcentajes de expresores cuádruples de estos marcadores positivos desde el pasaje 7 en adelante hasta los pasajes posteriores.
Las subpoblaciones inmunofenotipadas se clasificaron utilizando el modo de clasificación de una sola célula, donde solo dos marcadores positivos y uno negativo constituyeron los criterios de inclusión. Esta metodología garantizó la viabilidad celular de las poblaciones clasificadas y mantuvo la proliferación celular después de la clasificación. La aplicación posterior para dicha clasificación se puede utilizar para evaluar la diferenciación específica del linaje para las subpoblaciones cerradas. Este enfoque se puede aplicar a otros sistemas de una sola célula para mejorar las condiciones de aislamiento y para adquirir información de marcadores de superficie celular múltiple.
Las células madre mesenquimales (MSC) pueden considerarse como una fuente escalable de células adecuadas para terapias basadas en células y pueden considerarse un sistema de referencia en medicina regenerativa. Estas células se pueden aislar de una variedad de fuentes en el cuerpo con diferentes orígenes tisulares1. Dependiendo de su tejido de origen, cada tipo de MSC muestra un comportamiento in vitro ambiguo2. Esto se observa bien en sus propiedades morfológicas y funcionales3. Múltiples estudios han demostrado variación intraclonal en las dimensiones, incluyendo la diferenciación tisular adulta, el estado genómico y la arquitectura metabólica y celular de las MSCs 2,4.
El inmunofenotipado de células ha sido una aplicación común de la citometría de flujo para la identificación de células madre y esto fue utilizado por la Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT) en 2006 para prescribir una lista de criterios mínimos para identificar células como MSC. Afirmó que junto con la adherencia plástica y la capacidad de diferenciarse en tres linajes (osteogénico, condrogénico y adipogénico) in vitro, ≥95% de la población celular debe expresar CD105, CD73, CD90, y estas células deben carecer de la expresión (≤2% positiva) de CD34, CD45, CD11b, CD14 y HLA-DR, medida por citometría de flujo5. A pesar de que las MSC se definieron mediante un conjunto de biomarcadores bajo los criterios mínimos de la ISCT, sus propiedades inmunes no pudieron compararse con estos biomarcadores y se necesitaba más allá de estos criterios para facilitar la cuantificación de las comparaciones entre estudios y las variaciones clonales2.
A pesar de las directrices marcadas por el ISCT, una amplia investigación sobre las MSC ha demostrado que existe heterogeneidad en esta población, lo que podría deberse a una multitud de factores, principalmente debido a la naturaleza ubicua de la heterogeneidad que surge entre los donantes de MSC6, las fuentes de tejidos7, las células individuales dentro de una población clonal8 y las condiciones de cultivo 2,9. 10. La caracterización y purificación de estas células primarias a partir de una variedad de fuentes de tejidos para garantizar la calidad y el destino celular son pasos clave en su producción. La necesidad de comprender las variaciones mostradas entre la población requiere un método eficiente para resolverlas en subpoblaciones que puedan dividirse y recogerse por separado11. Los análisis a nivel de una sola célula ayudan a superar los desafíos de la variación célula-célula, reducen el ruido biológico que surge de una población heterogénea y ofrecen la capacidad de investigar y caracterizar células raras12.
En función del propósito y los parámetros elegidos, se pueden emplear varios métodos para clasificar y enriquecer las poblaciones seleccionadas. Las técnicas de clasificación por células pueden comprender tanto la clasificación masiva como los métodos de clasificación por células. Mientras que la clasificación masiva puede enriquecer las poblaciones objetivo a través de la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)13, el fraccionamiento14 y la elutriación 15, la clasificación de células individuales puede enriquecer poblaciones más homogéneas mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)11. En la Tabla 1 se destaca un análisis comparativo de cada uno de estos métodos con su propio conjunto de ventajas y desventajas.
Tabla 1: Análisis comparativos de diferentes técnicas: MACS, Fraccionamiento, Elutriación y FACS destacando las diferencias en su principio y las ventajas y desventajas de elegir una técnica en particular sobre otra. Abreviaturas: MACS = Clasificación celular activada magnéticamente; FACS = Clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Desde el advenimiento de la técnica, la citometría de flujo de una sola célula ha desempeñado un papel importante en la enumeración16, detección y caracterización de una población celular específica en una muestra heterogénea17. Hewitt et al. en 2006 sentaron las bases de la metodología de clasificación celular automatizada para mejorar el aislamiento de grupos homogéneos de células madre embrionarias humanas diferenciadas (hESCs)18. La clasificación unicelular enriqueció la población de células madre embrionarias transducidas por GFP, facilitando el aislamiento de clones modificados genéticamente, lo que abrió una nueva dimensión en la investigación clínica. Para mejorar la eficiencia de la clasificación, generalmente se han adoptado dos enfoques; O bien se modifican los medios de recolección de las poblaciones clasificadas para mantener la viabilidad y proliferación de las células posclasificadas19 o bien se modifica adecuadamente el algoritmo/software de clasificación celular12.
Con el avance de la tecnología, los citómetros de flujo comerciales y los clasificadores celulares han podido ayudar a abordar los desafíos que se enfrentaron al clasificar asépticamente poblaciones celulares frágiles y raras, especialmente células madre de diferentes orígenes. Uno de los principales desafíos de los biólogos de células madre ha sido el aislamiento clonal de células madre pluripotentes humanas siguiendo los protocolos de transfección requeridos en los estudios de edición génica19. Esto se abordó mediante la clasificación de células individuales en placas de 96 pocillos que se recubrieron con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) junto con suplementos e inhibidores comerciales de ROCK de moléculas pequeñas. Sin embargo, las estrategias de aislamiento celular podrían refinarse en gran medida con el uso de la clasificación por índices, una característica del algoritmo de clasificación que identifica el inmunofenotipo de las células individuales clasificadas12. Esta modalidad refinada en la clasificación de células individuales ayudó no solo a mejorar la eficiencia de clasificación de las células madre, especialmente en lo que respecta a las poblaciones de células madre hematopoyéticas raras, sino que también vinculó de manera eficiente los clones de células individuales a sus ensayos funcionales posteriores20.
Este artículo se centra en la clasificación unicelular de células madre inmunofenotipadas de dientes deciduos exfoliados humanos (SHEDs) para el enriquecimiento de subpoblaciones con el fin de estudiar sus capacidades de diferenciación funcional. Utilizando una combinación de dos marcadores MSC positivos, CD90 y CD73, y un marcador hematopoyético negativo CD45, se inmunofenotiparon las MSC y se identificaron los expresores dim y null. Con base en su inmunofenotipo, las subpoblaciones se identificaron como MSC puras, poblaciones positivas simples y poblaciones negativas dobles. Se clasificaron utilizando el modo de clasificación de una sola célula para obtener subpoblaciones puras y enriquecidas para estudios funcionales posteriores con el fin de identificar si la expresión diferencial de los marcadores era un artefacto de las condiciones de cultivo in vitro o si también tiene algún efecto sobre las propiedades funcionales. Las células que no eran expresoras homogéneas de los “marcadores MSC positivos” se clasificaron para estudiar sus propiedades funcionales.
En el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, entre las fuentes postnatales, las MSC derivadas de tejidos orales han atraído un profundo interés debido a sus obligaciones éticas mínimas y a su notable potencial de diferenciación multilinaje21. Las células madre de la pulpa dental (CPD) del tercer molar impactado y las SHEDs han atraído la mayor atención entre las MSC dentales por su potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y traumáticas<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a la Instalación de Celdas de Flujo del Centro Jawaharlal Nehru para la Investigación Científica Avanzada, Bangalore, India, por el uso de la instalación central de citometría de flujo. El criocorte del cultivo de gránulos de células diferenciadas se realizó en el Laboratorio de Referencia Neuberg Anand, Bangalore, India. Este trabajo fue apoyado por el financiamiento interno de la UC de la Academia de Educación Superior de Manipal (MAHE), India. AG agradece el apoyo de la Beca Dr. T. M. A. Pai de MAHE.
Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |