Summary
O presente protocolo descreve instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em camundongos neonatais para edição gênica e liberação de drogas.
Abstract
A injeção intratecal é um procedimento comumente empregado em clínicas pediátricas e de adultos, servindo como um meio eficaz para administrar medicamentos e tratamentos. Ao administrar diretamente medicamentos e tratamentos no líquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central, esse método alcança maiores concentrações localizadas de drogas enquanto reduz os efeitos colaterais sistêmicos em comparação com outras vias, como injeções intravenosas, subcutâneas ou intramusculares. Sua importância vai além dos cenários clínicos, já que a injeção intratecal desempenha um papel vital em estudos pré-clínicos focados no tratamento de distúrbios neurogenéticos em roedores e outros animais de grande porte, incluindo primatas não humanos. No entanto, apesar de sua ampla aplicação, a injeção intratecal em filhotes jovens, particularmente neonatais, apresenta desafios técnicos significativos devido ao seu pequeno tamanho e natureza frágil. A administração bem-sucedida e confiável de injeções intratecais em camundongos recém-nascidos requer atenção meticulosa aos detalhes e consideração cuidadosa de vários fatores. Assim, há uma necessidade crucial de um protocolo padronizado que não apenas forneça instruções, mas também destaque as principais considerações técnicas e boas práticas de laboratório para garantir a consistência do procedimento, bem como a segurança e o bem-estar dos animais.
Para atender a essa necessidade não atendida, apresentamos um protocolo detalhado e abrangente para a realização de injeções intratecais especificamente em filhotes recém-nascidos no dia 1 pós-natal (P1). Seguindo as instruções passo a passo, os pesquisadores podem realizar com confiança injeções intratecais em filhotes neonatais, permitindo a entrega precisa de drogas, oligos antisenso e vírus para substituição de genes ou tratamentos baseados em edição de genoma. Além disso, ressalta-se a importância da adesão às boas práticas laboratoriais para manter o bem-estar dos animais e garantir resultados experimentais confiáveis. Este protocolo visa abordar os desafios técnicos associados às injeções intratecais em camundongos neonatais, facilitando os avanços no campo da pesquisa neurogenética que visa desenvolver potenciais intervenções terapêuticas.
Introduction
A injeção intratecal (TI) é um procedimento clínico comum usado para administrar medicamentos, coletar líquido cefalorraquidiano e manter a pressão intracraniana em pacientes pediátricos e adultos em clínicas 1,2. A administração de medicamentos por injeção intratecal é uma abordagem eficaz para aumentar as concentrações de medicamentos no sistema nervoso central (SNC), minimizando a exposição sistêmica. Consequentemente, esse método aumenta a eficácia terapêutica e reduz os efeitos colaterais, especialmente para fármacos sensíveis à temperatura e de meia-vida curta3.
Em estudos pré-clínicos testando novas drogas e tratamentos utilizando modelos de roedores, é imperativo empregar um método confiável de administração de medicamentos que ofereça maior precisão e reprodutibilidade dos resultados 4,5. Para estudos pré-clínicos que avaliam novos tratamentos para transtornos neurogenéticos e do neurodesenvolvimento, o tratamento precoce é crucial para estudos iniciais de prova de conceito, pois intervenções mais precoces são tipicamente previstas para produzir resultados mais favoráveis 6,7,8.
Em comparação com as injeções intracerebroventriculares (ICV) convencionais, as injeções de IT apresentam riscos significativamente menores, uma vez que evitam a necessidade de penetração direta através do córtex cerebral. Essa vantagem reduz substancialmente o dano potencial ao tecido cortical regional e nervos adjacentes. Além disso, as injeções de TI permitem um aumento de pelo menos cinco vezes no volume administrável de medicamentos por meio de uma única injeção, aumentando consideravelmente a viabilidade de administrações repetidas. No entanto, devido ao pequeno tamanho e à natureza frágil dos camundongos recém-nascidos, a realização de injeções intratecais em filhotes recém-nascidos é tecnicamente desafiadora e requer técnicas especializadas, equipamentos e manuseio meticuloso.
Este artigo fornece um protocolo detalhado com instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em filhotes recém-nascidos P1. As principais considerações e boas práticas de laboratório são enfatizadas aqui para garantir a consistência da administração e a segurança e bem-estar dos animais durante o procedimento. Ao seguir esse protocolo, os pesquisadores podem conduzir experimentos com confiança com precisão e reprodutibilidade, minimizando quaisquer riscos potenciais ou desconforto para os animais.
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Protocol
Os procedimentos e protocolos descritos estavam de acordo com as diretrizes descritas no National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Além disso, os procedimentos receberam aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Yale. Camundongos recém-nascidos selvagens (WT) C57BL/6J machos e fêmeas foram usados para o estudo apresentado. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação do espaço de trabalho
- Preparar primeiro os seguintes itens: gelo úmido para crioanestesia, gaiola vazia para separar os filhotes da mãe, microscópio dissecante, fonte de luz, superfície limpa para colocar o animal durante a injeção, cotonetes, almofada térmica, seringa de 25/10 μL e agulha de 34 G/0,375"/12 DEG (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A crioanestesia para filhotes de camundongos usando gelo úmido é uma etapa opcional destinada a facilitar o manuseio, reduzir o movimento do filhote e minimizar o potencial desconforto do animal. Essa etapa da crioanestesia também pode proporcionar o benefício da redução da pressão intracraniana e das complicações relacionadas ao volume 9,10. - Mova os filhotes para uma gaiola separada longe da represa enquanto os manuseia.
- Pese cada filhote e documente seu peso.
- Limpe a parte de trás do mouse usando gaze e etanol. Confirme o espaço intervertebral ou, no mínimo, a linha média do canal vertebral (que deve aparecer vermelha nos filhotes P1) usando o microscópio dissecante (Vídeo Suplementar 1).
2. Procedimento de injeção
- Para anestesiar um único filhote, coloque-o suavemente em uma barreira à prova d'água, como uma manga de látex ou papel alumínio em um banho de gelo por 3-5 min. É importante evitar deixar o animal no gelo por um período prolongado, pois isso pode representar riscos potenciais de complicações relacionadas à hipotermia, incluindo fibrilação ventricular, hipóxia tecidual e acidose metabólica.
NOTA: A duração de 3-5 min pode variar caso a caso. Avalie os sinais da anestesia, como falta de resposta a uma pinça do dedo do pé, para determinar a duração apropriada. - Enquanto o animal estiver no gelo, carregue a seringa com 10 μL da formulação do medicamento, preparação do vírus, ou controle do líquido espinhal artificial, etc.
NOTA: Durante a fase de aprendizagem, considere a opção de injetar o mesmo volume de corante Fast Green misturado a 1% com os materiais de entrega (consulte a Tabela de Materiais). Isso pode ajudar na visualização do processo de injeção e auxiliar no aprendizado e refinamento da técnica. Os filhotes injetados com Fast Green Dye ou materiais similares devem ser eutanasiados logo após a injeção, de acordo com o protocolo aprovado, pois esses materiais podem resultar em reações inflamatórias ou outros efeitos colaterais em animais. - Uma vez que o animal esteja totalmente anestesiado, como confirmado por movimentos corporais reduzidos ou ausentes, posicione suavemente os filhotes sob o microscópio.
- Com o dedo indicador e polegar esquerdos, palpar cuidadosamente o espaço intervertebral ao longo da linha média, situado entre as cinturas pélvicas bilaterais (Vídeo Suplementar 1). Gire suavemente a base da cauda ligeiramente para ajudar a identificar a linha média da coluna vertebral.
- Ajustar o bisel da agulha em direção à cabeça do animal antes da injeção.
- Introduza cuidadosamente a agulha, inclinando-a ligeiramente para um ângulo de 70°-80° no ponto em que a indentação se cruza, garantindo que a seringa permaneça alinhada com o plano sagital central. À medida que a agulha entra em contato com o osso, diminua gradualmente o ângulo para aproximadamente 30° e, em seguida, avance a agulha cerca de 2 mm para o espaço intervertebral.
NOTA: A capacidade da agulha de levantar ligeiramente todo o corpo é um sinal de entrada bem-sucedida no espaço intradural. - Injetar lentamente até 10 μL de volume dentro de 50-60 s. Mantenha a agulha no lugar por 10-20 s após a conclusão do parto. Retire a agulha com uma rotação suave para evitar fugas.
NOTA: O cerebelo ficará verde antes de retirar a agulha. Além disso, o impulso lento é fundamental para prevenir o aumento da pressão intracraniana associada ao parto e minimizar possíveis complicações. Com base em nossa experiência com injeções em mais de 500 filhotes, entregar um volume de 10 μL acima de 50-60 s é o ideal.
3. Pós-injeção
- Aplique um cotonete no local da injeção se houver vazamento ou sangue.
NOTA: Não deve haver nenhum na maioria dos casos. Pela nossa experiência, filhotes tratados com vestígios de vazamento ou sangue ainda são utilizáveis, mas a consideração de uma dose reduzida de medicamentos ou tratamentos pode ser necessária durante a análise dos dados. - Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento e aguarde 10-15 minutos para que os filhotes se recuperem totalmente e se aqueçam. Observe cuidadosamente os filhotes para garantir que eles estejam alertas e se movendo ativamente antes de devolvê-los à gaiola de casa. A recuperação adequada de um camundongo é indicada pela restauração da cor rosa da pele, aumento do movimento espontâneo do corpo e reações responsivas ao toque.
- Coloque o filhote de volta na gaiola de casa e certifique-se de que o filhote esteja devidamente coberto com roupa de cama, ninho ou ambos. Isso garante que o filhote receba os cuidados maternos necessários da represa.
- Avaliar a aparência geral e atividade diariamente por pelo menos 3 dias após a injeção. Uma aparência doente e atividade reduzida podem aumentar a possibilidade de infecção, efeitos colaterais associados ao tratamento, ou outras complicações, etc. Se necessário, consulte o atendimento veterinário.
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Representative Results
A injeção intratecal bem-sucedida resultou imediatamente na distribuição generalizada da solução administrada, embora a penetração celular real dependesse da natureza dos medicamentos e materiais administrados. Neste estudo, utilizamos o Fast Green para visualizar os resultados imediatos após a injeção intratecal (TI) em neonatos selvagens (Figura 1A-K) e comparamos com a injeção intracerebroventricular (VCI) convencional (Figura 1L-N). Os resultados a longo prazo (10 dias após a injeção) também foram examinados usando camundongos repórteres YFP ativados pela liberação de edição genética baseada em CRISPR/Cas97. A expressão de YFP foi observada amplamente em todo o cérebro de camundongos em comparação com camundongos não tratados com CRISPR/Cas9 (Figura 2). A expressão de YFP foi observada na maioria das células sob maior magnificação. Injeções foram realizadas em mais de 500 filhotes recém-nascidos, e mais de 98% dos filhotes injetados sobreviveram ao procedimento. Não foram observados efeitos deletérios na sobrevivência e saúde dos filhotes tratados a longo prazo (Figura 1 Suplementar).
Figura 1: Distribuição temporal e espacial do corante Fast Green em cérebros de camundongos. (A) Observação macroscópica de camundongos, comparando camundongos injetados e não injetados 5 min após a injeção intratecal. (B) Visualização da distribuição do corante Fast Green no cérebro de camundongos antes da dissecção. (C-E) Distribuição do corante em cérebros dissecados 5 min após administração intratecal. (F-H) Distribuição do corante em cérebros dissecados 30 min após administração intratecal. (I-K) Distribuição do corante em cérebros dissecados 60 min após administração intratecal. (L-N) Para comparação, a distribuição do corante em cérebros dissecados 40 min após a administração intracerebroventricular. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos a longo prazo da edição genética CRISPR/Cas9 administrada por via intratecal. Expressão generalizada do repórter YFP no cérebro de camundongos após injeção intratecal de edição do gene CRISPR/Cas9: cerebelo (A-F), córtex posterior (D-F) e córtex pré-frontal (G-I). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Curva de sobrevida de camundongos com Síndrome de Angelman após edição intratecal do gene CRISPR. Curva de sobrevivência que descreve os resultados de camundongos com Síndrome de Angelman que receberam edição genética CRISPR por administração intratecal, em comparação com camundongos não tratados e selvagens. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 1: Procedimento de injeção intratecal em camundongos neonatais. Vídeo demonstrando o processo de administração de injeções intratecais em camundongos neonatais. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Descrito é um procedimento passo-a-passo para injeção intratecal em camundongos neonatais (P1), resultando em ampla distribuição de drogas em seus cérebros. Em comparação com o método comum de injeção intracerebroventricular para administração de medicamentos em camundongos neonatais, que envolve perfuração do córtex cerebral11, a injeção intratecal evita lesão direta no cérebro neonatal de camundongos devido à penetração da agulha. Devido à mínima invasividade, a injeção intratecal pode ser realizada repetidamente quando necessário, simulando administrações repetidas em humanos em um ambiente clínico12.
Alterações na pressão intracraniana são comumente associadas à injeção intratecal13, podendo levar à rejeição e recusa alimentar da mãe devido a mudanças comportamentais nos filhotes. No entanto, mudanças agudas no comportamento ou redução da sobrevida entre filhotes injetados não foram observadas. Da mesma forma, comportamentos incomuns ou anormais associados a injeções intratecais em adultos não foram notados (dados não mostrados).
Várias dicas técnicas podem ter contribuído para o sucesso e merecem destaque. A taxa mais lenta de injeção é provavelmente um fator importante. Além disso, a crioanestesia pode reduzir a pressão intracraniana antes da injeção, minimizando o refluxo durante a injeção intratecal e reduzindo outras complicações. Por fim, a precisão do local de injeção também pode afetar a taxa de sucesso.
Para obter a melhor eficácia via administração intratecal, realizar o procedimento o mais rápido possível após o nascimento dos filhotes é fundamental. Drogas e outras substâncias administradas por injeção intratecal entram no espaço intratecal, que é o espaço entre as camadas aracnoide e pia-máter das meninges que envolvem o cérebro e a medula espinhal. Portanto, os fármacos administrados por injeção intratecal passam por essas camadas das meninges12. Em roedores, assim como em humanos, as meninges são constituídas por três camadas: dura-máter, aracnoide e pia-máter14. Essas membranas se formam durante o desenvolvimento embrionário e estão completamente maduras até o 2º dia pós-natal (P2)15. Portanto, recomenda-se o uso de um protocolo de genotipagem rápida para atribuir os filhotes a grupos experimentais em poucas horas, especialmente para experimentos envolvendo genótipos animais, como experimentos de edição de genes. Quanto mais cedo os filhotes forem injetados, melhor será o resultado. As injeções são tipicamente concluídas dentro de 3 h após o nascimento. Essa janela de tempo permite que as drogas injetadas acompanhem o fluxo de líquido cefalorraquidiano para o parênquima cerebral, enquanto o revestimento ependimário ainda é imaturo e menos afetado pelo tamanho das partículas da droga. Vale a pena notar as diferenças de desenvolvimento entre humanos e camundongos. Camundongos neonatais P1 correspondem ao estágio gestacional tardio do desenvolvimento cerebral humano16. Resultados de experimentos em camundongos neonatais P1 servem como prova valiosa de conceito, mas deve-se ter cautela ao extrapolar esses resultados para humanos em desenhos de estudos translacionais.
Essa técnica é desafiada por uma janela de tempo de administração restrita e pela exigência de experimentadores altamente qualificados. Alta mortalidade pode estar associada ao procedimento se o experimentador não tiver experiência. No entanto, o curto período de tempo exige um nível elevado de precisão e repetibilidade dentro e entre os estudos. Além disso, com a prática adequada, a proficiência e a taxa de sucesso desse método podem ser significativamente aumentadas.
Se as injeções forem realizadas corretamente, a sobrevivência dos filhotes injetados é afetada principalmente pelos cuidados maternos. Recomenda-se preparar pares femininos adotivos para seus alvos. Se os filhotes visados não tiverem uma mancha de leite na barriga na tarde do dia da injeção, eles devem ser transferidos para a fêmea adotiva imediatamente. Camundongos fêmeas reconhecem seus bebês pelo odor. Portanto, é fundamental evitar a introdução de odores desconhecidos de experimentadores ou barragens não relacionadas aos filhotes durante e após o procedimento. No entanto, a necessidade do uso de fêmeas adotivas deve ser avaliada para experimentos individuais. A realização do procedimento em uma sala bem ventilada, idealmente em uma capela biológica, também é recomendada. Misturar os filhotes com a cama e os excrementos da represa também é útil. Após a verificação inicial pós-procedimento, recomenda-se minimizar a perturbação da barragem por pelo menos 3 dias para reduzir o estresse. Como qualquer procedimento cirúrgico, o risco de infecção pós-procedimento deve ser considerado. Assim, a adesão rigorosa às boas práticas laboratoriais para procedimentos estéreis deve ser seguida durante a injeção. Deve-se notar que a pressão intratecal é maior do que o ambiente externo, proporcionando proteção natural contra infecção. A experiência indica que a taxa de infecção pós-injeção é rara. No entanto, recomenda-se o monitoramento diário da aparência geral e da atividade dos filhotes por pelo menos 3 dias após a injeção para detectar sinais e sintomas de infecção ou outras complicações. Em casos especiais, a consulta com serviços veterinários pode ser justificada em vez de eutanasiar filhotes com complicações significativas.
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Disclosures
YHJ é co-fundador da Couragene, mas não há conflito de interesses para este projeto.
Acknowledgments
A XNL é apoiada pela Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ também é apoiado pela FAST e NIH Grant R01HD110195 e R01MH117289.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
