Summary
Den nåværende protokollen skisserer trinnvise instruksjoner for å utføre intratekale injeksjoner i nyfødte mus for genredigering og legemiddellevering.
Abstract
Intratekal injeksjon er en vanlig prosedyre i både pediatriske og voksne klinikker, som tjener som et effektivt middel til å administrere medisiner og behandlinger. Ved direkte å levere medisiner og behandlinger i cerebrospinalvæsken i sentralnervesystemet, oppnår denne metoden høyere lokaliserte legemiddelkonsentrasjoner samtidig som systemiske bivirkninger reduseres sammenlignet med andre ruter som intravenøse, subkutane eller intramuskulære injeksjoner. Dens betydning strekker seg utover kliniske innstillinger, da intratekal injeksjon spiller en viktig rolle i prekliniske studier fokusert på behandling av nevrogenetiske lidelser hos gnagere og andre store dyr, inkludert ikke-menneskelige primater. Til tross for den utbredte anvendelsen, utgjør intratekal injeksjon hos unge, spesielt nyfødte valper, betydelige tekniske utfordringer på grunn av deres lille størrelse og skjøre natur. Vellykket og pålitelig administrering av intratekale injeksjoner hos nyfødte mus krever nøye oppmerksomhet på detaljer og nøye vurdering av ulike faktorer. Det er derfor et avgjørende behov for en standardisert protokoll som ikke bare gir instruksjoner, men også fremhever viktige tekniske hensyn og god laboratoriepraksis for å sikre prosessuell konsistens, samt dyrenes sikkerhet og velferd.
For å imøtekomme dette udekkede behovet, presenterer vi en detaljert og omfattende protokoll for å utføre intratekale injeksjoner spesifikt hos nyfødte avkom på postnatal dag 1 (P1). Ved å følge trinnvise instruksjoner, kan forskere trygt utføre intratekale injeksjoner i nyfødte valper, noe som muliggjør nøyaktig levering av medisiner, antisense oligos og virus for genutskifting eller genomredigeringsbaserte behandlinger. Videre understrekes viktigheten av å følge god laboratoriepraksis for å opprettholde dyrs velvære og sikre pålitelige eksperimentelle resultater. Denne protokollen tar sikte på å løse de tekniske utfordringene knyttet til intratekale injeksjoner i nyfødte mus, og til slutt legge til rette for fremskritt innen nevrogenetisk forskning som tar sikte på å utvikle potensielle terapeutiske inngrep.
Introduction
Intratekal (IT) injeksjon er en vanlig klinisk prosedyre som brukes til å administrere medisiner, samle cerebrospinalvæske og opprettholde intrakranielt trykk hos både pediatriske og voksne pasienter i klinikker 1,2. Administrering av medisiner via intratekal injeksjon er en effektiv tilnærming for å øke medisinkonsentrasjonen i sentralnervesystemet (CNS) samtidig som systemisk eksponering minimeres. Følgelig forbedrer denne metoden terapeutisk effekt og reduserer bivirkninger, spesielt for temperaturfølsomme og korte halveringstidsmedikamenter3.
I prekliniske studier som tester nye stoffer og behandlinger ved hjelp av gnagermodeller, er det viktig å bruke en pålitelig metode for legemiddeladministrasjon som gir større presisjon og resultatreproduserbarhet 4,5. For prekliniske studier som evaluerer nye behandlinger for nevrogenetiske og nevrodevelopmental lidelser, er tidlig behandling avgjørende for innledende proof-of-concept-studier fordi tidligere intervensjoner vanligvis forventes å gi gunstigere resultater 6,7,8.
Sammenlignet med konvensjonelle intracerebroventrikulære (ICV) injeksjoner, har IT-injeksjoner betydelig lavere risiko siden de unngår behovet for direkte penetrasjon gjennom hjernebarken. Denne fordelen reduserer den potensielle skaden på regionalt kortikalt vev og omkringliggende nerver betydelig. Videre tillater IT-injeksjoner minst en femdobling i det administrerbare volumet av medisiner gjennom en enkelt injeksjon, noe som øker muligheten for gjentatte administrasjoner. På grunn av den lille størrelsen og skjøre naturen til nyfødte mus, er det imidlertid teknisk utfordrende å utføre intratekale injeksjoner hos nyfødte valper og krever spesialiserte teknikker, utstyr og grundig håndtering.
Denne artikkelen gir en detaljert protokoll med trinnvise instruksjoner for å utføre intratekale injeksjoner i P1 nyfødte valper. De viktigste hensynene og god laboratoriepraksis vektlegges her for å sikre konsistent administrasjon og dyrenes sikkerhet og trivsel under prosedyren. Ved å følge denne protokollen kan forskere trygt utføre eksperimenter med presisjon og reproduserbarhet samtidig som potensielle risikoer eller ubehag for dyrene minimeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beskrevne prosedyrene og protokollene var i samsvar med retningslinjene som er skissert i National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. I tillegg fikk prosedyrene godkjenning fra Animal Care and Use Committee ved Yale University School of Medicine. Nyfødte villtype (WT) C57BL/6J hann- og hunnmus ble brukt til presentert studie. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse).
1. Klargjøring av arbeidsområdet
- Forbered følgende elementer først: våt is for kryo-anestesi, et tomt bur for å skille valpene fra dammen, et dissekerende mikroskop, en lyskilde, en ren overflate for å plassere dyret under injeksjonen, bomullspinner, en varmepute, en 25/10 μL sprøyte og en 34 G / 0,375 "/ 12 DEG nål (se materialfortegnelse).
NOTAT: Kryobedøvelse for musevalper som bruker våt is er et valgfritt trinn som er ment å lette håndtering, redusere valpens bevegelse og minimere potensielt ubehag hos dyr. Dette kryoanestesitrinnet kan også gi fordelen av å senke intrakranielt trykk og redusere volumrelaterte komplikasjoner 9,10. - Flytt valpene til et eget bur vekk fra demningen mens du håndterer dem.
- Vei hver valp og dokumenter vekten.
- Tørk baksiden av musen med gasbind og etanol. Bekreft det intervertebrale rommet eller i det minste midtlinjen i ryggraden (som skal vises rødt i P1-valper) ved hjelp av dissekeringsmikroskopet (tilleggsvideo 1).
2. Injeksjon prosedyre
- For å bedøve en enkelt valp, legg den forsiktig på en vanntett barriere som en latexhylse eller aluminiumsfolie på et isbad i 3-5 minutter. Det er viktig å unngå å forlate dyret på isen i en lengre periode, da det kan utgjøre potensielle risikoer for hypotermirelaterte komplikasjoner, inkludert ventrikkelflimmer, vevshypoksi og metabolsk acidose.
MERK: Varigheten på 3-5 min kan variere fra sak til sak. Vurder tegn på anestesi, for eksempel manglende respons på en tåklemme, for å bestemme riktig varighet. - Mens dyret er på isen, legg sprøyten med 10 μL av legemiddelformuleringen, viruspreparatet eller kontroller kunstig spinalvæske, etc.
MERK: I læringsfasen, vurder muligheten for å injisere samme volum av blandet 1% Fast Green fargestoff med leveringsmaterialene (se Materialfortegnelse). Dette kan hjelpe til med å visualisere injeksjonsprosessen og hjelpe til med å lære og raffinere teknikken. Valper injisert med Fast Green Dye eller lignende materialer bør avlives kort tid etter injeksjon i henhold til godkjent protokoll, da disse materialene kan føre til inflammatoriske reaksjoner eller andre bivirkninger hos dyr. - Når dyret er fullt bedøvet, som bekreftet av redusert eller fraværende kroppsbevegelse, plasser valpene forsiktig under mikroskopet.
- Palperer forsiktig det intervertebrale rommet langs midtlinjen med venstre pekefinger og tommel, plassert mellom de bilaterale bekkenbeltene (tilleggsvideo 1). Roter forsiktig bunnen av halen litt for å identifisere midtlinjen i ryggraden.
- Still nålen på skrålinjen mot dyrets hode før injeksjon.
- Sett kanylen forsiktig inn og vipp den litt til en vinkel på 70°-80° på det punktet hvor fordypningen skjærer hverandre, samtidig som sprøyten forblir på linje med det sentrale sagittalplanet. Når nålen kommer i kontakt med benet, reduseres vinkelen gradvis til ca. 30°, og nålen føres deretter ca. 2 mm inn i det intervertebrale rommet.
MERK: Nålens evne til å løfte hele kroppen litt er et tegn på vellykket inngang i det intradurale rommet. - Injiser sakte opptil 10 μL volum innen 50-60 s. Hold nålen på plass i 10-20 s etter at fødselen er fullført. Trekk kanylen forsiktig ut med en forsiktig rotasjon for å unngå lekkasje.
MERK: Lillehjernen blir grønn før nålen trekkes ut. Den langsomme push er også avgjørende for å forhindre en økning i intrakranielt trykk forbundet med levering og for å minimere potensielle komplikasjoner. Basert på vår erfaring med injeksjoner i mer enn 500 unger, er det optimalt å levere et volum på 10 μL over 50-60 s.
3. Etter injeksjon
- Påfør en bomullspinne på injeksjonsstedet hvis det lekker eller er blod.
MERK: Det bør ikke være noen i de fleste tilfeller. Vår erfaring er at valper behandlet med spor av lekkasje eller blod fortsatt er brukbare, men det kan være nødvendig å vurdere redusert dose medikamenter eller behandlinger under dataanalysen. - Plasser valpen på en varmepute og la valpene komme seg helt og varme opp i 10-15 minutter. Observer valpene nøye for å sikre at de er våkne og aktivt beveger seg før de returnerer dem til hjemmeburet. Tilstrekkelig gjenoppretting av en mus indikeres ved restaurering av rosa hudfarge, økt spontan kroppsbevegelse og responsive reaksjoner på berøring.
- Plasser valpen tilbake i hjemmeburet og sørg for at valpen er ordentlig dekket med sengetøy, reir eller begge deler. Dette sikrer at valpen får nødvendig mors omsorg fra dammen.
- Vurder generelt utseende og aktivitet daglig i minst 3 dager etter injeksjon. Et sykefravær og redusert aktivitet kan øke muligheten for infeksjon, behandlingsrelaterte bivirkninger eller andre komplikasjoner mv. Rådfør deg om nødvendig med veterinærpleie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket intratekal injeksjon resulterte umiddelbart i utbredt distribusjon av den administrerte løsningen, selv om den faktiske cellulære penetrasjonen var avhengig av arten av de leverte legemidlene og materialene. I denne studien brukte vi Fast Green til å visualisere de umiddelbare resultatene etter intratekal injeksjon (IT) hos villtype nyfødte (figur 1A-K) og sammenlignet det med konvensjonell intracerebroventrikulær (ICV) injeksjon (figur 1L-N). De langsiktige resultatene (10 dager etter injeksjon) ble også undersøkt ved hjelp av YFP-reportermus aktivert ved levering av CRISPR / Cas9-basert genredigering7. YFP-ekspresjon ble observert mye over hele musehjernen sammenlignet med mus som ikke var CRISPR/Cas9-behandlet (figur 2). Ekspresjonen av YFP ble observert i de fleste celler under høyere forstørrelse. Injeksjoner ble utført i mer enn 500 nyfødte valper, og over 98% av de injiserte valpene overlevde prosedyren. Det ble ikke observert skadelige effekter på langtidsoverlevelse og helse hos behandlede valper (tilleggsfigur 1).
Figur 1: Tidsmessig og romlig fordeling av Fast Green fargestoff i musehjerner. (A) Grov observasjon av mus, sammenligning av injiserte og ikke-injiserte mus 5 minutter etter intratekal injeksjon. (B) Visualisering av fordelingen av Fast Green fargestoff i musehjernen før disseksjon. (VG Nett) Fordeling av fargestoffet i dissekerte hjerner 5 minutter etter intratekal administrering. (VG Nett) Fordeling av fargestoffet i dissekerte hjerner 30 minutter etter intratekal administrering. (I-K) Fordeling av fargestoffet i dissekerte hjerner 60 min etter intratekal administrering. (LN) Til sammenligning, fordelingen av fargestoffet i dissekerte hjerner 40 min etter intracerebroventrikulær administrering. Skala bar: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Langtidseffekter av intratekalt administrert CRISPR/Cas9-genredigering. Utbredt uttrykk for YFP-reporteren i musehjernen etter intratekal injeksjon av CRISPR/Cas9-genredigering: cerebellum (A-F), posterior cortex (D-F) og prefrontal cortex (G-I). Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Overlevelseskurve for mus med Angelmansyndrom etter intratekal CRISPR-genredigering. Overlevelseskurve som viser utfallet av Angelman syndrom-mus som mottar CRISPR-genredigering gjennom intratekal administrasjon, sammenlignet med ikke-behandlede og villtype mus. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende video 1: Intratekal injeksjonsprosedyre hos nyfødte mus. Video som demonstrerer prosessen med å levere intratekale injeksjoner til nyfødte mus. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet er en trinnvis prosedyre for intratekal injeksjon hos nyfødte mus (P1), noe som resulterer i utbredt legemiddeldistribusjon i hjernen. I forhold til den vanlige intracerebroventrikulære injeksjonsmetoden for å levere medisiner til nyfødte mus, som innebærer piercing av hjernebarken11, unngår intratekal injeksjon direkte skade på den neonatale musehjernen på grunn av nålpenetrasjon. På grunn av minimal invasivitet kan intratekal injeksjon utføres gjentatte ganger når det er nødvendig, og simulerer gjentatte administreringer hos mennesker i en klinisk setting12.
Endringer i intrakranielt trykk er ofte forbundet med intratekal injeksjon13, noe som potensielt fører til dammens avvisning og nektelse av å mate på grunn av atferdsendringer hos valpene. Akutte endringer i atferd eller redusert overlevelse blant injiserte avkom er imidlertid ikke observert. På samme måte har uvanlig eller unormal atferd forbundet med intratekale injeksjoner hos voksne ikke blitt lagt merke til (data ikke vist).
Flere tekniske tips kan ha bidratt til suksessen og er verdt å understreke. Den langsommere injeksjonshastigheten er sannsynligvis en viktig faktor. I tillegg kan kryoanestesi redusere intrakranielt trykk før injeksjonen, minimere tilbakestrømning under intratekal injeksjon og redusere andre komplikasjoner. Til slutt kan presisjonen på injeksjonsstedet også påvirke suksessraten.
For å oppnå best mulig effekt via intratekal administrering, er det avgjørende å utføre prosedyren så snart som mulig etter at valpene er født. Legemidler og andre stoffer levert via intratekal injeksjon går inn i det intratekale rommet, som er mellomrommet mellom arachnoid mater og pia mater-lagene i hjernehinnene som omgir hjernen og ryggmargen. Derfor passerer legemidlene som leveres via intratekal injeksjon gjennom disse lagene i meningene12. Hos gnagere, som hos mennesker, består meningene av tre lag: dura mater, arachnoid mater og pia mater14. Disse membranene dannes under embryonal utvikling og er fullt modne ved postnatal dag 2 (P2) 15. Derfor anbefales det å bruke en rask genotypingsprotokoll for å tildele valpene til eksperimentelle grupper innen få timer, spesielt for eksperimenter som involverer dyregenotyper, for eksempel genredigeringseksperimenter. Jo tidligere valpene injiseres, desto bedre blir resultatet. Injeksjonene er vanligvis ferdig innen 3 timer etter fødselen. Dette tidsvinduet tillater de injiserte legemidlene å følge strømmen av cerebrospinalvæske inn i hjerneparenkymet, mens ependymalforingen fortsatt er umoden og mindre påvirket av størrelsen på legemiddelpartikler. Det er verdt å merke seg utviklingsforskjellene mellom mennesker og mus. P1 neonatale mus tilsvarer det sene svangerskapsstadiet av menneskelig hjerneutvikling16. Resultater fra eksperimenter på P1 neonatale mus tjener som verdifullt bevis på konsept, men forsiktighet bør utvises når man ekstrapolerer disse resultatene til mennesker i translasjonsstudiedesign.
Denne teknikken utfordres av et begrenset administrasjonstidsvindu og kravet til dyktige eksperimenter. Høy dødelighet kan være forbundet med prosedyren hvis eksperimentøren mangler erfaring. Den smale tidsrammen krever imidlertid et økt presisjonsnivå og repeterbarhet innenfor og mellom studier. Videre, med tilstrekkelig praksis, kan ferdigheten og suksessraten for denne metoden bli betydelig forbedret.
Hvis injeksjonene utføres riktig, påvirkes overlevelsen av injiserte valper primært av mors omsorg. Det anbefales å forberede fosterhunnpar for målene dine. Hvis de målrettede valpene ikke har en melkeflekk på magen om ettermiddagen på injeksjonsdagen, bør de overføres til fosterhunnen umiddelbart. Kvinnelige mus gjenkjenner sine babyer ved lukt. Derfor er det viktig å unngå å introdusere ukjent lukt fra eksperimenter eller ikke-relaterte dammer til valpene under og etter prosedyren. Nødvendigheten av å bruke fosterhunner bør imidlertid vurderes for individuelle forsøk. Det anbefales også å utføre prosedyren i et godt ventilert rom, ideelt i en biologisk avtrekkshette. Å blande valpene med dammens sengetøy og ekskrementer er også nyttig. Etter den første post-prosedyrekontrollen anbefales det å minimere forstyrrelser i dammen i minst 3 dager for å redusere stress. Som enhver kirurgisk prosedyre, bør risikoen for infeksjon etter prosedyren vurderes. Derfor bør streng overholdelse av god laboratoriepraksis for sterile prosedyrer følges under injeksjonen. Det skal bemerkes at intratekalt trykk er høyere enn det ytre miljø, noe som gir naturlig beskyttelse mot infeksjon. Erfaring indikerer at frekvensen av infeksjon etter injeksjon er sjelden. Daglig overvåking av avkommets generelle utseende og aktivitet i minst 3 dager etter injeksjon anbefales imidlertid for å oppdage tegn og symptomer på infeksjon eller andre komplikasjoner. I spesielle tilfeller kan konsultasjon med veterinærtjenester være berettiget i stedet for å avlive valper med betydelige komplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YHJ er en av grunnleggerne av Couragene, men ingen interessekonflikt for dette prosjektet.
Acknowledgments
XNL støttes av Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ støttes også av FAST og NIH Grant R01HD110195 og R01MH117289.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
