Summary
В настоящем протоколе изложены пошаговые инструкции по выполнению интратекальных инъекций новорожденным мышам для редактирования генов и доставки лекарств.
Abstract
Интратекальная инъекция является широко используемой процедурой как в педиатрических, так и во взрослых клиниках, служащей эффективным средством для введения лекарств и лечения. Путем непосредственной доставки лекарств и методов лечения в спинномозговую жидкость центральной нервной системы, этот метод позволяет достичь более высоких локализованных концентраций лекарств при одновременном снижении системных побочных эффектов по сравнению с другими путями, такими как внутривенные, подкожные или внутримышечные инъекции. Его значение выходит за рамки клинических условий, поскольку интратекальная инъекция играет жизненно важную роль в доклинических исследованиях, направленных на лечение нейрогенетических расстройств у грызунов и других крупных животных, включая нечеловекообразных приматов. Однако, несмотря на широкое применение, интратекальные инъекции у молодых, особенно новорожденных детенышей, представляют собой значительные технические проблемы из-за их небольшого размера и хрупкой природы. Успешное и надежное введение интратекальных инъекций новорожденным мышам требует тщательного внимания к деталям и тщательного учета различных факторов. Таким образом, существует острая необходимость в стандартизированном протоколе, который не только содержит инструкции, но и освещает ключевые технические соображения и надлежащую лабораторную практику для обеспечения согласованности процедур, а также безопасности и благополучия животных.
Чтобы удовлетворить эту неудовлетворенную потребность, мы представляем подробный и всеобъемлющий протокол выполнения интратекальных инъекций, в частности, новорожденным щенкам на 1-й день после рождения (P1). Следуя пошаговым инструкциям, исследователи могут уверенно выполнять интратекальные инъекции новорожденным щенкам, обеспечивая точную доставку лекарств, антисмысловых олиго и вирусов для замены генов или лечения на основе редактирования генома. Кроме того, подчеркивается важность соблюдения надлежащей лабораторной практики для поддержания благополучия животных и обеспечения надежных результатов экспериментов. Этот протокол направлен на решение технических проблем, связанных с интратекальными инъекциями у новорожденных мышей, что в конечном итоге способствует прогрессу в области нейрогенетических исследований, направленных на разработку потенциальных терапевтических вмешательств.
Introduction
Интратекальная (ИТ) инъекция является распространенной клинической процедурой, используемой для введения лекарств, сбора спинномозговой жидкости и поддержания внутричерепного давления как у детей, так и у взрослых пациентов в клиниках 1,2. Введение лекарственных препаратов путем интратекальной инъекции является эффективным подходом для повышения концентрации лекарств в центральной нервной системе (ЦНС) при минимизации системного воздействия. Следовательно, этот метод повышает терапевтическую эффективность и уменьшает побочные эффекты, особенно для термочувствительных препаратов и препаратов с коротким периодом полувыведения3.
В доклинических исследованиях по испытанию новых лекарственных средств и методов лечения с использованием моделей грызунов необходимо использовать надежный метод введения лекарственных средств, обеспечивающий большую точность и воспроизводимость результатов 4,5. Для доклинических исследований, оценивающих новые методы лечения нейрогенетических расстройств и нарушений развития нервной системы, раннее лечение имеет решающее значение для первоначальных исследований, подтверждающих концепцию, поскольку более ранние вмешательства, как правило, дают более благоприятные исходы 6,7,8.
По сравнению с обычными внутримозговыми инъекциями (ИКВ), ИТ-инъекции сопряжены со значительно меньшими рисками, поскольку они устраняют необходимость прямого проникновения через кору головного мозга. Это преимущество существенно снижает потенциальное повреждение регионарной корковой ткани и окружающих нервов. Кроме того, ИТ-инъекции позволяют, по крайней мере, в пять раз увеличить объем вводимых лекарств за одну инъекцию, что значительно повышает возможность повторного введения. Однако из-за небольшого размера и хрупкой природы новорожденных мышей выполнение интратекальных инъекций новорожденным щенкам технически сложно и требует специализированных методов, оборудования и тщательного обращения.
В данной статье представлен подробный протокол с пошаговой инструкцией по выполнению интратекальных инъекций новорожденным щенкам P1. Здесь особое внимание уделяется ключевым соображениям и надлежащей лабораторной практике для обеспечения последовательности введения, а также безопасности и благополучия животных во время процедуры. Следуя этому протоколу, исследователи могут уверенно проводить эксперименты с точностью и воспроизводимостью, сводя к минимуму любые потенциальные риски или дискомфорт для животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанные процедуры и протоколы соответствовали рекомендациям, изложенным в Руководстве Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Кроме того, процедуры получили одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Йельского университета. Для исследования были использованы новорожденные мыши дикого типа (WT) C57BL/6J самца и самки. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
1. Подготовка рабочего пространства
- Сначала подготовьте следующие предметы: влажный лед для криоанестезии, пустую клетку для отделения детенышей от матери, препарирующий микроскоп, источник света, чистую поверхность для размещения животного во время инъекции, ватные палочки, грелку, шприц 25/10 мкл и иглу 34 G/ 0,375"/12 DEG (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Криоанестезия для детенышей мышей с использованием влажного льда является необязательным шагом, предназначенным для облегчения обращения, уменьшения движений щенка и минимизации потенциального дискомфорта животного. Этот этап криоанестезии также может способствовать снижению внутричерепного давления и уменьшению осложнений, связанных с объемом 9,10. - Переместите щенков в отдельную клетку подальше от плотины, пока вы берете их на руки.
- Взвесьте каждого щенка и задокументируйте его вес.
- Протрите заднюю часть мыши с помощью марли и этилового спирта. Подтвердите межпозвонковое пространство или, как минимум, среднюю линию спинномозгового канала (которая должна быть красной у щенков P1) с помощью препарирующего микроскопа (дополнительное видео 1).
2. Процедура инъекции
- Чтобы обезболить одного щенка, осторожно поместите его на водонепроницаемый барьер, такой как латексный рукав или алюминиевая фольга, на ледяную баню на 3-5 минут. Важно не оставлять животное на льду в течение длительного периода времени, так как это может создать потенциальный риск осложнений, связанных с гипотермией, включая фибрилляцию желудочков, гипоксию тканей и метаболический ацидоз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность 3-5 минут может варьироваться в каждом конкретном случае. Оцените признаки анестезии, такие как отсутствие реакции на защемление пальца ноги, чтобы определить соответствующую продолжительность. - Пока животное находится на льду, загрузите в шприц 10 мкл лекарственной формы, препарата вируса или контролирующей искусственной спинномозговой жидкости и т.д.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе обучения рассмотрите возможность введения того же объема смешанного 1% красителя Fast Green с материалами для доставки (см. Таблицу материалов). Это может помочь визуализировать процесс инъекции, а также помочь в изучении и совершенствовании техники. Щенков, которым вводят краситель Fast Green или аналогичные материалы, следует усыпить вскоре после инъекции в соответствии с утвержденным протоколом, так как эти материалы могут вызвать воспалительные реакции или другие побочные эффекты у животных. - После того, как животное будет полностью обезболино, что подтверждается уменьшением или отсутствием движений тела, осторожно поместите детенышей под микроскоп.
- Указательным и большим пальцами левой руки осторожно пальпируют межпозвонковое пространство по средней линии, расположенное между двусторонними тазовыми поясами (Дополнительное видео 1). Осторожно слегка поверните основание хвоста, чтобы определить среднюю линию позвоночника.
- Перед инъекцией отрегулируйте скос иглы по направлению к голове животного.
- Осторожно введите иглу, слегка наклонив ее под углом 70°-80° в месте пересечения углубления, при этом следя за тем, чтобы шприц оставался выровненным по центральной сагиттальной плоскости. По мере того, как игла соприкасается с костью, постепенно уменьшайте угол примерно до 30°, затем продвигайте иглу примерно на 2 мм в межпозвонковое пространство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Способность иглы слегка приподнимать все тело является признаком успешного вхождения в интрадуральное пространство. - Медленно вводите объем до 10 мкл в течение 50-60 с. Держите иглу на месте в течение 10-20 секунд после завершения родов. Извлеките иглу плавным вращением, чтобы избежать протекания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозжечок позеленеет перед извлечением иглы. Кроме того, медленные потуги имеют решающее значение для предотвращения повышения внутричерепного давления, связанного с родами, и для минимизации потенциальных осложнений. Основываясь на нашем опыте инъекций более чем 500 щенкам, оптимальным является предоставление объема 10 мкл в течение 50-60 с.
3. Пост-инъекция
- Приложите ватный тампон к месту инъекции, если есть подтекание или кровь.
ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев их не должно быть. По нашему опыту, щенки, у которых были обнаружены следы подтекания или крови, все еще пригодны к использованию, но при анализе данных может потребоваться рассмотрение уменьшенной дозы лекарств или лечения. - Положите щенка на грелку и подождите 10-15 минут, чтобы щенки полностью восстановились и согрелись. Внимательно наблюдайте за щенками, чтобы убедиться, что они бдительны и активно двигаются, прежде чем возвращать их в домашнюю клетку. Адекватное выздоровление мыши обозначается восстановлением розового цвета кожи, усилением спонтанных движений тела, отзывчивыми реакциями на прикосновения.
- Поместите щенка обратно в домашнюю клетку и убедитесь, что он должным образом накрыт подстилкой, гнездом или и тем, и другим. Это гарантирует, что детеныш получит необходимую материнскую заботу от матери.
- Оценивайте общий вид и активность ежедневно в течение не менее 3 дней после инъекции. Болезненный внешний вид и снижение активности могут повысить вероятность инфекции, побочных эффектов, связанных с лечением, или других осложнений и т. д. При необходимости проконсультируйтесь с ветеринарной службой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешная интратекальная инъекция немедленно приводила к широкому распространению введенного раствора, хотя фактическое проникновение в клетки зависело от характера доставляемых лекарств и материалов. В этом исследовании мы использовали Fast Green для визуализации немедленных результатов после интратекальной инъекции (ИТ) у новорожденных дикого типа (рис. 1A-K) и сравнили его с обычной интрацеребровентрикулярной инъекцией (ICV) (рис. 1L-N). Отдаленные результаты (через 10 дней после инъекции) также изучали на мышах-репортерах YFP, активированныхпри редактировании генов на основе CRISPR/Cas9. Экспрессия YFP наблюдалась по всему мозгу мышей по сравнению с мышами, не получавшими CRISPR/Cas9 (рис. 2). Экспрессия YFP наблюдалась в большинстве клеток при большем увеличении. Инъекции были сделаны более чем 500 новорожденным щенкам, и более 98% щенков, получивших инъекции, выжили после процедуры. Вредного воздействия на долгосрочную выживаемость и здоровье пролеченных щенков не наблюдалось (дополнительный рисунок 1).
Рисунок 1: Временное и пространственное распределение красителя Fast Green в мозге мышей. (A) Грубое наблюдение за мышами, сравнивающими мышей с инъекциями и без инъекций через 5 минут после интратекальной инъекции. (Б) Визуализация распределения красителя Fast Green в мозге мыши перед вскрытием. (К-Э) Распределение красителя в препарированном мозге через 5 мин после интратекального введения. (Ф-Х) Распределение красителя в препарированном мозге через 30 мин после интратекального введения. (И-К) Распределение красителя в препарированном мозге через 60 мин после интратекального введения. (Л-Н) Для сравнения, распределение красителя в препарированном мозге через 40 мин после внутримозгового введения. Масштабная линейка: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Долгосрочные эффекты интратекального редактирования гена CRISPR/Cas9. Широко распространенная экспрессия репортера YFP в мозге мышей после интратекальной инъекции редактирования гена CRISPR/Cas9: мозжечок (A-F), задняя кора (D-F) и префронтальная кора (G-I). Масштабная линейка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Кривая выживаемости мышей с синдромом Ангельмана после интратекального редактирования гена CRISPR. Кривая выживаемости, показывающая исходы мышей с синдромом Ангельмана, получавших редактирование генов CRISPR путем интратекального введения, по сравнению с мышами, не получавшими лечения, и мышами дикого типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительное видео 1: Процедура интратекальной инъекции у неонатальных мышей. Видео, демонстрирующее процесс введения интратекальных инъекций новорожденным мышам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описана пошаговая процедура интратекальной инъекции новорожденным мышам (Р1), приводящая к широкому распространению препарата в их головном мозге. По сравнению с распространенным методом внутримозговой инъекции для введения лекарства новорожденным мышам, который включает в себя прокалывание коры головного мозга11, интратекальная инъекция позволяет избежать прямого повреждения мозга новорожденной мыши из-за проникновения иглы. Благодаря минимальной инвазивности интратекальная инъекция может выполняться многократно, когда это необходимо, имитируя повторные введения у людей в клинических условиях12.
Изменения внутричерепного давления обычно связаны с интратекальной инъекцией13, что потенциально может привести к отторжению самки и отказу от кормления из-за поведенческих изменений у детенышей. Однако резких изменений в поведении или снижения выживаемости среди щенков, получивших инъекции, не наблюдалось. Аналогичным образом, необычное или аномальное поведение, связанное с интратекальными инъекциями у взрослых, не было замечено (данные не показаны).
Несколько технических советов, возможно, способствовали успеху и заслуживают внимания. Более медленная скорость впрыска, вероятно, является важным фактором. Кроме того, криоанестезия может снизить внутричерепное давление перед инъекцией, сводя к минимуму обратный ток во время интратекальной инъекции и уменьшая другие осложнения. Наконец, точность места инъекции также может повлиять на вероятность успеха.
Для достижения наилучшей эффективности при интратекальном введении крайне важно провести процедуру как можно скорее после рождения щенков. Лекарственные препараты и другие вещества, доставляемые с помощью интратекальной инъекции, попадают в интратекальное пространство, которое представляет собой пространство между арахноидальным матищем и мистым матром мозговых оболочек, окружающих головной и спинной мозг. Поэтому лекарственные средства, доставляемые путем интратекального введения, проходят через эти слои мозговых оболочек12. У грызунов, как и у человека, мозговые оболочки состоят из трех слоев: твердой мозговой оболочки, арахноидальной оболочки и pia mater14. Эти оболочки формируются во время эмбрионального развития и полностью созревают ко 2-му дню построждения (P2)15. Поэтому рекомендуется использовать протокол быстрого генотипирования для распределения детенышей по экспериментальным группам в течение нескольких часов, особенно для экспериментов с участием генотипов животных, таких как эксперименты по редактированию генов. Чем раньше щенкам будет сделана инъекция, тем лучше результат. Инъекции обычно завершаются в течение 3 часов после рождения. Это временное окно позволяет вводимым препаратам следовать за потоком спинномозговой жидкости в паренхиму головного мозга, в то время как эпендимальная оболочка еще незрелая и менее подвержена влиянию размера частиц лекарства. Стоит отметить различия в развитии между людьми и мышами. Неонатальные мыши P1 соответствуют поздней гестационной стадии развития мозга человека16. Результаты экспериментов на неонатальных мышах линии P1 служат ценным доказательством концепции, но следует проявлять осторожность при экстраполяции этих результатов на людей в дизайне трансляционных исследований.
Этот метод осложняется ограниченным временным окном введения и требованием высококвалифицированных экспериментаторов. Высокая смертность может быть связана с процедурой, если экспериментатору не хватает опыта. Тем не менее, узкие временные рамки требуют повышенного уровня точности и воспроизводимости как внутри исследований, так и между ними. Кроме того, при адекватной практике мастерство и успешность этого метода могут быть значительно повышены.
Если инъекции выполнены правильно, на выживаемость детенышей, которым сделали инъекции, в первую очередь влияет материнская забота. Рекомендуется подготовить приемные пары самок для ваших целей. Если во второй половине дня в день инъекции у целевых щенков на животе нет молочного пятна, их следует немедленно перевести к приемной самке. Самки мышей узнают своих детенышей по запаху. Поэтому очень важно избегать введения незнакомых запахов от экспериментаторов или посторонних маток к детенышам во время и после процедуры. Тем не менее, необходимость использования приемных самок должна быть оценена для индивидуальных экспериментов. Также рекомендуется проводить процедуру в хорошо проветриваемом помещении, в идеале в биологическом вытяжном шкафу. Также полезно смешивать щенков с подстилкой и экскрементами самки. После первоначальной проверки после процедуры рекомендуется свести к минимуму нарушение плотины в течение как минимум 3 дней, чтобы уменьшить стресс. Как и при любой хирургической процедуре, следует учитывать риск послепроцедурной инфекции. Таким образом, во время инъекции следует строго придерживаться надлежащей лабораторной практики для стерильных процедур. Следует отметить, что интратекальное давление выше, чем во внешней среде, обеспечивая естественную защиту от инфекции. Опыт показывает, что частота постинъекционной инфекции встречается редко. Тем не менее, рекомендуется ежедневный мониторинг общего внешнего вида и активности щенков в течение не менее 3 дней после инъекции для выявления признаков и симптомов инфекции или других осложнений. В особых случаях может потребоваться консультация с ветеринарными службами вместо эвтаназии щенков со значительными осложнениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YHJ является соучредителем Couragene, но конфликта интересов в этом проекте нет.
Acknowledgments
XNL поддерживается Фондом терапевтической терапии синдрома Ангельмана (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ также поддерживается FAST и NIH Grant R01HD110195 и R01MH117289.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
