Transient midterste cerebral arterieokklusionsmodel af slagtilfælde
Summary
Denne protokol beskriver modellen af forbigående fokal cerebral iskæmi hos mus gennem intraluminal okklusion af den midterste cerebrale arterie. Derudover vises eksempler på resultatvurdering ved hjælp af magnetisk resonansbilleddannelse og adfærdstest.
Abstract
Slagtilfælde står som en væsentlig årsag til død eller kronisk handicap globalt. Ikke desto mindre er eksisterende optimale behandlinger begrænset til reperfusionsterapier i den akutte fase af iskæmisk slagtilfælde. For at få indsigt i slagtilfælde fysiopatologi og udvikle innovative terapeutiske tilgange, in vivo gnavermodeller af slagtilfælde spiller en grundlæggende rolle. Tilgængeligheden af genetisk modificerede dyr har især fremmet brugen af mus som eksperimentelle slagtilfældemodeller.
Hos patienter med slagtilfælde er okklusion af den midterste cerebrale arterie (MCA) en almindelig forekomst. Derfor involverer den mest udbredte eksperimentelle model intraluminal okklusion af MCA, en minimalt invasiv teknik, der ikke kræver kraniektomi. Denne procedure indebærer indsættelse af et monofilament gennem den ydre halspulsåre (ECA) og fremme den gennem den indre halspulsåre (ICA), indtil den når MCA’s forgreningspunkt. Efter en 45 minutters arteriel okklusion fjernes monofilamentet for at tillade reperfusion. Under hele processen overvåges cerebral blodgennemstrømning for at bekræfte reduktionen under okklusion og efterfølgende genopretning ved reperfusion. Neurologiske og vævsresultater evalueres ved hjælp af adfærdstest og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) undersøgelser.
Introduction
Slagtilfælde er en ødelæggende sygdom, der rammer ca. 15 millioner mennesker verden over årligt, ifølge WHO. Omkring en tredjedel af patienterne bukker under for tilstanden, mens en anden tredjedel oplever permanent invaliditet. Slagtilfælde er en kompleks patologi, der involverer forskellige celletyper, såsom neurale og perifere immunceller, vaskulatur og systemiske reaktioner1. Det indviklede netværk af reaktioner udløst af slagtilfælde på systemniveau kan i øjeblikket ikke replikeres ved hjælp af in vitro-modeller . Derfor er eksperimentelle dyremodeller afgørende for at dykke ned i sygdommens mekanismer og udvikle og teste nye terapier. I øjeblikket er tidlig vævsreperfusion den eneste godkendte intervention, enten gennem trombolyse med vævstype plasminogenaktivator (tPA) eller endovaskulær trombektomi1.
Okklusioner af den midterste cerebrale arterie (MCA) er hyppige hos patienter med slagtilfælde. Derfor blev gnavermodeller af forbigående MCA-okklusion (tMCAo) oprindeligt udviklet hos rotter 2,3,4. I dag er genetisk modificerede mus de mest almindeligt anvendte dyr i eksperimentelle slagtilfældemodeller. I denne undersøgelse beskriver vi en minimalt invasiv model af intraluminal tMCAo hos mus. Fremgangsmåden udføres via halspulsåren på nakkeniveau uden kraniektomi.
Varigheden af okklusionsperioden er en kritisk faktor, der bestemmer omfanget af den iskæmiske læsion. Selv korte okklusioner på 10 min kan forårsage selektiv neuronal død uden et tilsyneladende infarkt, mens længere okklusioner, der typisk varer 30 til 60 min, resulterer i en vis grad af cerebral infarkt. I modsætning til de proksimale og distale grene af MCA, der leverer cortex og har collaterals, mangler lenticulo-striatale arterier, der leverer blod til striatum, sikkerhedsstillelser5. Som følge heraf er der en større reduktion af blodgennemstrømningen i striatum end i cortex efter tMCAo. Således påvirker okklusioner på 30 min eller mindre generelt striatum, men ikke cortex, mens længere okklusioner, fra 45 min og fremefter, ofte genererer en iskæmisk læsion i hele MCA-territoriet, herunder striatum og dorsolateral cortex.
For at sikre musenes velbefindende administrerer vi smertestillende midler inden proceduren og bruger anæstesi under operationen. Ikke desto mindre kan anæstesi potentielt indføre kunstige ændringer i musens fysiologi og påvirke nogle resultatmål6. Det kirurgiske indgreb, når det udføres af erfarent personale, varer normalt ca. 15 minutter for at inducere MCAo. Derefter afhænger den samlede tid under anæstesi af okklusionsperioden. For eksperimenter, hvor minimering af anæstesi er afgørende, involverer et alternativt trin i proceduren seponering af anæstesi i okklusionsperioden og begrænser det kun til de kirurgiske trin til indsættelse og tilbagetrækning af filamentet, der udelukker MCA. Denne fremgangsmåde reducerer varigheden af anæstesi og minimerer dens potentielle kunstige virkninger på den eksperimentelle model 7,8. Derfor præsenteres metoden til inducering af forbigående fokal iskæmi ved intraluminal okklusion af MCA med to varianter: med musen bedøvet i hele okklusionsperioden eller med musen vågen i denne periode. I begge tilfælde bør en skinoperation udføres parallelt med interventionen udført på de iskæmiske mus. Derudover leveres data om resultatvurdering målt ved adfærdstest og MR på forskellige tidspunkter efter reperfusion. Endelig diskuteres de vigtigste faktorer, der skal overvejes ved gennemførelsen af forsøgsproceduren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intraluminale tMCAo-procedure er den mest almindeligt anvendte model af fokal hjerneiskæmi med reperfusion i grundforskning. I øjeblikket er mus den foretrukne dyremodel på grund af tilgængeligheden af genetisk modificerede stammer. Det er dog vigtigt at erkende, at genetisk modificerede mus og deres genetiske baggrund kan påvirke hjernens vaskularisering. Tilstedeværelsen af sikkerhedscirkulation og anastomoser mellem forskellige arterielle territorier kan påvirke resultaterne af eksperimentelle procedurer<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelse støttet af tilskud PID2020-113202RB-I00 finansieret af Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 og “Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU). En måde at skabe Europa på”. NCC og MAR havde prædoktorale stipendier (henholdsvis PRE2021-099481 og PRE2018-085737) finansieret af MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 og af “Den Europæiske Socialfond (ESF) Investering i din fremtid”. Vi takker Francisca Ruiz-Jaén og Leonardo Márquez-Kisinousky for deres tekniske support. Vi anerkender støtten fra MR-billeddannelsesfaciliteten hos Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Centre de Recerca de Catalunya (CERCA) Program of Generalitat de Catalunya understøtter IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
Riferimenti
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
