Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico
Summary
Este protocolo descreve o modelo de isquemia cerebral focal transitória em camundongos através da oclusão intraluminal da artéria cerebral média. Além disso, exemplos de avaliação de resultados são mostrados usando ressonância magnética e testes comportamentais.
Abstract
O AVC é uma das principais causas de morte ou incapacidade crônica em todo o mundo. No entanto, os tratamentos ideais existentes são limitados às terapias de reperfusão durante a fase aguda do acidente vascular cerebral isquêmico. Para obter informações sobre a fisiopatologia do AVC e desenvolver abordagens terapêuticas inovadoras, modelos in vivo de roedores de AVC desempenham um papel fundamental. A disponibilidade de animais geneticamente modificados tem impulsionado particularmente o uso de camundongos como modelos experimentais de AVC.
Em pacientes com acidente vascular encefálico, a oclusão da artéria cerebral média (ACM) é uma ocorrência comum. Consequentemente, o modelo experimental mais prevalente envolve a oclusão intraluminal da ACM, uma técnica minimamente invasiva que não requer craniectomia. Esse procedimento consiste em inserir um monofilamento através da artéria carótida externa (ECA) e avançá-lo através da artéria carótida interna (ACI) até atingir o ponto de ramificação da ACM. Após 45 min de oclusão arterial, o monofilamento é removido para permitir a reperfusão. Durante todo o processo, o fluxo sanguíneo cerebral é monitorado para confirmar a redução durante a oclusão e posterior recuperação após a reperfusão. Os resultados neurológicos e teciduais são avaliados por meio de testes comportamentais e estudos de ressonância magnética (RM).
Introduction
O AVC é uma doença devastadora que afeta aproximadamente 15 milhões de pessoas em todo o mundo anualmente, de acordo com a OMS. Cerca de um terço dos pacientes sucumbe à condição, enquanto outro terço experimenta incapacidade permanente. O acidente vascular encefálico (AVE) é uma patologia complexa que envolve vários tipos celulares, como células imunes neurais e periféricas, vasculatura e respostassistêmicas1. A intrincada rede de reações desencadeadas pelo AVC em nível de sistemas não pode ser replicada atualmente usando modelos in vitro . Assim, modelos animais experimentais são essenciais para aprofundar os mecanismos da doença e desenvolver e testar novas terapias. Atualmente, a reperfusão tecidual precoce é a única intervenção aprovada, seja por meio de trombólise com ativador de plasminogênio tecidual (tPA) ou trombectomia endovascular1.
Oclusões da artéria cerebral média (ACM) são frequentes em pacientes com acidente vascular encefálico. Consequentemente, modelos roedores de oclusão transitória da MCA (tMCAo) foram inicialmente desenvolvidos emratos2,3,4. Atualmente, camundongos geneticamente modificados são os animais mais utilizados em modelos experimentais de AVC. Neste estudo, descrevemos um modelo minimamente invasivo de tMCAo intraluminal em camundongos. A abordagem é realizada através da artéria carótida ao nível do pescoço, sem craniectomia.
A duração do período de oclusão é um fator crítico que determina a extensão da lesão isquêmica. Mesmo oclusões curtas de 10 min podem causar morte neuronal seletiva sem um infarto aparente, enquanto oclusões mais longas, tipicamente com duração de 30 a 60 min, resultam em algum grau de infarto cerebral. Ao contrário dos ramos proximal e distal da ACM que suprem o córtex e possuem colaterais, as artérias lentículo-estriatais que fornecem sangue para o estriado carecem de colaterais5. Como consequência, há maior redução do fluxo sanguíneo no estriado do que no córtex após a tMCAo. Assim, oclusões de 30 min ou menos geralmente afetam o estriado, mas não o córtex, enquanto oclusões mais longas, a partir de 45 min, frequentemente geram uma lesão isquêmica em todo o território da ACM, incluindo o estriado e o córtex dorsolateral.
Para garantir o bem-estar dos camundongos, administramos analgésicos antes do procedimento e usamos anestesia durante a cirurgia. No entanto, a anestesia pode potencialmente introduzir alterações artificiais na fisiologia do camundongo e afetar algumas medidas de desfecho6. A intervenção cirúrgica, quando realizada por pessoal experiente, geralmente dura cerca de 15 min para indução de MCAo. Posteriormente, o tempo total de anestesia depende do período de oclusão. Para experimentos em que minimizar a anestesia é crucial, uma etapa alternativa do procedimento envolve a interrupção da anestesia durante o período de oclusão e limitá-la apenas às etapas cirúrgicas para inserir e retirar o filamento que oclui a ACM. Essa abordagem reduz a duração da anestesia e minimiza seus potenciais efeitos artefatuais no modelo experimental 7,8. Portanto, o método de indução de isquemia focal transitória é apresentado pela oclusão intraluminal da ACM com duas variantes: com o camundongo anestesiado durante todo o período de oclusão ou com o camundongo acordado durante esse período. Em ambos os casos, uma cirurgia simulada deve ser realizada em paralelo com a intervenção realizada nos camundongos isquêmicos. Além disso, dados sobre a avaliação do desfecho são fornecidos medidos por testes comportamentais e ressonância magnética em vários momentos após a reperfusão. Finalmente, os principais fatores a serem considerados na implementação do procedimento experimental são discutidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento de tMCAo intraluminal é o modelo mais comumente utilizado de isquemia cerebral focal com reperfusão em pesquisa básica. Atualmente, camundongos são o modelo animal preferido devido à disponibilidade de linhagens geneticamente modificadas. No entanto, é essencial reconhecer que camundongos geneticamente modificados e suas origens genéticas podem afetar a vascularização cerebral. A presença de circulação colateral e anastomoses entre diferentes territórios arteriais pode influenciar significativ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estudo apoiado pela subvenção PID2020-113202RB-I00 financiado pelo Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 e “Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER). Uma forma de fazer a Europa”. NCC e MAR tiveram bolsas de pré-doutorado (PRE2021-099481 e PRE2018-085737, respectivamente) financiadas pelo MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 e pelo “Fundo Social Europeu (FSE) Investir no seu futuro”. Agradecemos a Francisca Ruiz-Jaén e Leonardo Márquez-Kisinousky pelo apoio técnico. Agradecemos o apoio do serviço de imagem por RM do Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). O Programa Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) da Generalitat de Catalunya apoia o IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
Riferimenti
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