뇌졸중의 일시적인 중뇌동맥 폐색 모델
Summary
이 프로토콜은 중뇌동맥의 내강 내 폐색을 통한 마우스의 일시적인 국소 대뇌 허혈 모델을 설명합니다. 또한 자기 공명 영상 및 행동 테스트를 사용하여 결과 평가의 예를 보여줍니다.
Abstract
뇌졸중은 전 세계적으로 사망 또는 만성 장애의 주요 원인입니다. 그럼에도 불구하고 기존의 최적 치료법은 허혈성 뇌졸중의 급성기 동안 재관류 요법으로 제한되어 있습니다. 뇌졸중 생리병리학에 대한 통찰력을 얻고 혁신적인 치료법을 개발하기 위해서는 뇌졸중의 생체 내 설치류 모델이 근본적인 역할을 합니다. 유전자 변형 동물의 가용성은 특히 실험용 뇌졸중 모델로 마우스의 사용을 촉진했습니다.
뇌졸중 환자에서 중뇌동맥(MCA)의 폐색은 흔한 현상입니다. 결과적으로, 가장 널리 사용되는 실험 모델은 두개골 절제술이 필요하지 않은 최소 침습 기술인 MCA의 내강 내 폐색과 관련이 있습니다. 이 절차에는 외부 경동맥(ECA)을 통해 모노필라멘트를 삽입하고 MCA의 분기점에 도달할 때까지 내부 경동맥(ICA)을 통해 전진시키는 작업이 포함됩니다. 45분 동맥 폐색 후 모노필라멘트를 제거하여 재관류를 허용합니다. 이 과정에서 뇌 혈류를 모니터링하여 폐색 중 감소와 재관류 시 후속 회복을 확인합니다. 신경 및 조직 결과는 행동 검사와 자기 공명 영상(MRI) 연구를 사용하여 평가됩니다.
Introduction
WHO에 따르면 뇌졸중은 매년 전 세계적으로 약 1,500만 명에게 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. 환자의 약 3분의 1은 이 질환에 걸리고, 또 다른 3분의 1은 영구적인 장애를 경험합니다. 뇌졸중은 신경 및 말초 면역 세포, 혈관 조직 및 전신 반응과 같은 다양한 세포 유형을 포함하는 복잡한 병리학입니다1. 시스템 수준에서 뇌졸중에 의해 유발되는 복잡한 반응 네트워크는 현재 체외 모델을 사용하여 복제할 수 없습니다. 따라서 실험 동물 모델은 질병의 메커니즘을 탐구하고 새로운 치료법을 개발 및 테스트하는 데 필수적입니다. 현재 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA)를 이용한 혈전용해술 또는 혈관내 혈전절제술을 통한 조기 조직 재관류가 유일하게 승인된 중재이다1.
중뇌동맥(MCA)의 폐색은 뇌졸중 환자에서 빈번하게 발생합니다. 결과적으로, 일시적인 MCA 폐색(tMCAo)의 설치류 모델은 처음에 쥐 2,3,4에서 개발되었습니다. 오늘날 유전자 변형 마우스는 실험용 뇌졸중 모델에서 가장 일반적으로 사용되는 동물입니다. 이 연구에서는 생쥐에서 내강 내 tMCAo의 최소 침습 모델을 설명합니다. 이 접근법은 두개골 절제술 없이 목 수준의 경동맥을 통해 수행됩니다.
교합 기간의 지속 시간은 허혈성 병변의 정도를 결정하는 중요한 요소입니다. 10분의 짧은 교합도 명백한 경색 없이 선택적 신경세포 사멸을 유발할 수 있는 반면, 일반적으로 30분에서 60분 동안 지속되는 긴 교합은 어느 정도의 뇌경색을 유발합니다. 대뇌피질에 혈액을 공급하고 측부를 가지고 있는 MCA의 근위부 및 원위부 분지와는 달리, 선조체에 혈액을 공급하는 렌즈-선조체 동맥에는 측부가 없다5. 그 결과, tMCAo 후 피질보다 선조체의 혈류량이 더 크게 감소합니다. 따라서 30분 이하의 교합은 일반적으로 선조체에 영향을 미치지만 피질에는 영향을 미치지 않는 반면, 45분 이후의 더 긴 교합은 종종 선조체와 배외측 피질을 포함한 전체 MCA 영역에 허혈성 병변을 생성합니다.
생쥐의 건강을 보장하기 위해 시술 전에 진통제를 투여하고 수술 중에는 마취제를 사용합니다. 그럼에도 불구하고, 마취는 잠재적으로 마우스의 생리학에 인위적인 변화를 일으킬 수 있으며, 일부 결과 측정에 영향을 미칠 수 있다6. 숙련된 직원이 수행할 때 외과적 개입은 MCAo를 유도하는 데 일반적으로 약 15분 동안 지속됩니다. 그 후, 마취 중인 총 시간은 교합 기간에 따라 다릅니다. 마취를 최소화하는 것이 중요한 실험의 경우, 절차의 대체 단계는 교합 기간 동안 마취를 중단하고 MCA를 폐색하는 필라멘트를 삽입하고 빼는 수술 단계로만 제한하는 것입니다. 이 접근법은 마취 기간을 줄이고 실험 모델 7,8에 대한 잠재적인 인공물 효과를 최소화합니다. 따라서, 일시적인 국소 허혈을 유도하는 방법은 두 가지 변형을 갖는 MCA의 내강 내 폐색에 의해 제시된다: 전체 교합 기간 동안 마우스를 마취하거나 이 기간 동안 마우스가 깨어 있는 상태에서. 두 경우 모두, 가짜 수술은 허혈성 마우스에 수행된 중재와 병행하여 수행되어야 합니다. 또한 결과 평가에 대한 데이터는 재관류 후 다양한 시점에서 행동 테스트 및 MRI로 측정된 대로 제공됩니다. 마지막으로, 실험 절차를 구현할 때 고려해야 할 주요 요소에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
내강 내 tMCAo 절차는 기초 연구에서 재관류와 함께 가장 일반적으로 사용되는 국소 뇌 허혈 모델입니다. 현재, 마우스는 유전자 변형 균주의 가용성으로 인해 선호되는 동물 모델입니다. 그러나 유전자 변형 쥐와 그 유전적 배경이 뇌 혈관화에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인정하는 것이 중요합니다. 서로 다른 동맥 영역 사이의 부수적 순환 및 문합체의 존재는 실험 절차의 결과에 상당한 영향을 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 및 “European Regional Development Fund (ERDF)”가 자금을 지원하는 보조금 PID2020-113202RB-I00의 지원을 받았습니다. 유럽을 만드는 방법”. NCC와 MAR은 MCIN/AEI/099481 501100011033/085737 및 “European Social Fund(ESF) Investing in your future”에서 자금을 지원하는 박사 전 펠로우십(각각 PRE2021-099481 및 PRE2018-13039)을 받았습니다. 기술 지원을 해주신 Francisca Ruiz-Jaén과 Leonardo Márquez-Kisinousky에게 감사드립니다. 우리는 Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS)의 MRI 영상 시설의 지원에 감사드립니다. 카탈루냐 총독의 카탈루냐 레세르카 센터(CERCA) 프로그램은 IDIBAPS를 지원합니다.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
Riferimenti
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
