从斑马鱼幼虫中分离肠道进行单细胞RNA测序

Summary

在这里，我们描述了一种在受精后 5 天从斑马鱼幼虫中分离肠道的方法，用于单细胞 RNA 测序分析。

Abstract

胃肠道 （GI） 执行一系列对生命至关重要的功能。影响其发育的先天性缺陷可导致肠道神经肌肉疾病，这凸显了了解胃肠道发育和功能障碍的分子机制的重要性。在这项研究中，我们提出了一种在受精后 5 天从斑马鱼幼虫中分离肠道的方法，以获得可用于单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 分析的活细胞。该协议基于斑马鱼肠道的手动解剖，然后与木瓜蛋白酶酶解离。随后，将细胞提交荧光激活细胞分选，并收集活细胞进行scRNA-seq。通过这种方法，我们能够成功地识别不同的肠道细胞类型，包括上皮细胞、基质细胞、血液细胞、肌肉细胞和免疫细胞，以及肠道神经元和神经胶质细胞。因此，我们认为它是使用斑马鱼研究胃肠道在健康和疾病中的组成方面的宝贵资源。

Introduction

胃肠道 （GI） 是一个复杂的系统，在整体健康和福祉中起着至关重要的作用。它负责营养物质的消化和吸收，以及废物的消除 ^1,2。胃肠道由多种细胞类型组成，包括上皮细胞、平滑肌细胞、免疫细胞和肠神经系统 （ENS），它们紧密地相互通信以调节和维持适当的肠道功能 ^3,4,5。胃肠道发育的缺陷会对营养吸收、微生物群组成、肠脑轴和 ENS 等各个方面产生深远的影响，导致多种肠道神经肌肉疾病，例如先天性巨结肠和慢性假性肠梗阻 ^6,7。这些疾病的特征是由各种关键细胞（例如 Cajal 的间质细胞、平滑肌细胞和 ENS ^6,8,9）的改变引起的严重肠道运动障碍。然而，胃肠道发育和功能障碍的分子机制仍然知之甚少。

斑马鱼是研究胃肠道发育和功能障碍的有价值的模式生物，因为它具有快速的胚胎发育、胚胎和幼虫阶段的透明度以及遗传可处理性 10,11,12,13,14。有许多表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系可供选择。这种品系的一个例子是tg（phox2bb：GFP）斑马鱼，通常用于研究ENS，因为所有phox2bb+细胞，包括肠神经元，都被标记为^15,16。在这里，使用tg（phox2bb：GFP）斑马鱼系，我们提出了一种在受精后5天（dpf）幼虫肠道分离的方法，用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图1）。

Protocol

所有斑马鱼的饲养和实验都是根据伊拉斯谟MC和动物福利立法的制度准则进行的。受精后 5 天使用斑马鱼幼虫属于不需要正式伦理批准的实验类别，如荷兰法规所述。 1.获得受精后5天（dpf）野生型和tg（phox2bb：GFP）幼虫 设置野生型斑马鱼的繁殖，并在 15 cm 培养皿中收集 50 个卵在 HEPES 缓冲的 E3 培养基（以下简称 E3）中。使用这些鱼作为荧光激活细?…

Representative Results

通过该协议，我们成功地从5个dpf幼虫中分离和解离了整个肠道。使用木瓜蛋白酶作为解离酶，我们显着增强了细胞活力，能够在 244 个分离的肠道中捕获 46,139 个涉及单个活细胞（占所有细胞的 6.4%）的事件（图 2A）。使用野生型全幼虫作为对照，以确保分选过程得到优化，从而实现有效的细胞鉴定和分选。整个幼虫可以用于我们只对活的单细胞进行分类（补充图S1B-E</…

Discussion

在这里，我们提出了一种使用FACS分离和解离5 dpf斑马鱼幼虫肠道的方法。通过这种方法，使用10x Genomics Chromium平台，通过scRNA-seq成功收集和分析了不同的肠道细胞类型。我们选择了tg（phox2bb：GFP）斑马鱼系，因为我们想要一个迹象，表明活的ENS细胞也将被分离出来（图2D）。然而，重要的是要注意，这种方法可以很容易地扩展到其他感兴趣的斑马鱼品系，因为我们只?…

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154