Summary

Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

Nous décrivons ici une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation, pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire.

Abstract

Le tractus gastro-intestinal (GI) remplit une série de fonctions essentielles à la vie. Les malformations congénitales affectant son développement peuvent entraîner des troubles neuromusculaires entériques, d’où l’importance de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal. Dans cette étude, nous présentons une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation afin d’obtenir des cellules vivantes et viables qui peuvent être utilisées pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Ce protocole est basé sur la dissection manuelle de l’intestin du poisson-zèbre, suivie d’une dissociation enzymatique avec de la papaïne. Par la suite, les cellules sont soumises à un tri cellulaire activé par fluorescence et les cellules viables sont collectées pour le scRNA-seq. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à identifier différents types de cellules intestinales, notamment les cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires et immunitaires, ainsi que les neurones entériques et les cellules gliales. Par conséquent, nous considérons qu’il s’agit d’une ressource précieuse pour étudier la composition du tractus gastro-intestinal dans la santé et la maladie, en utilisant le poisson-zèbre.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal (GI) est un système complexe qui joue un rôle essentiel dans la santé et le bien-être en général. Il est responsable de la digestion et de l’absorption des nutriments, ainsi que de l’élimination des déchets 1,2. Le tractus gastro-intestinal est composé de plusieurs types de cellules, y compris les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires et le système nerveux entérique (SNE), qui communiquent étroitement entre elles pour réguler et maintenir une fonction intestinale appropriée 3,4,5. Les défauts dans le développement du tractus gastro-intestinal peuvent avoir des effets considérables sur divers aspects tels que l’absorption des nutriments, la composition du microbiote, l’axe intestin-cerveau et le SNE, conduisant à plusieurs troubles neuromusculaires entériques, tels que la maladie de Hirschsprung et la pseudo-obstruction intestinale chronique 6,7. Ces troubles sont caractérisés par une dysmotilité intestinale sévère causée par des altérations de diverses cellules clés, telles que les cellules interstitielles de Cajal, les cellules musculaires lisses et l’ENS 6,8,9. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal sont encore mal compris.

Le poisson-zèbre est un organisme modèle précieux pour l’étude du développement et du dysfonctionnement gastro-intestinal en raison de son développement embryonnaire rapide, de sa transparence pendant les stades embryonnaire et larvaire et de sa tractabilité génétique 10,11,12,13,14. De nombreuses lignées transgéniques de poissons-zèbres exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles. Un exemple d’une telle lignée est le poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), couramment utilisé pour étudier le SNE, car toutes les cellules phox2bb+, y compris les neurones entériques, sont étiquetées15,16. Ici, en utilisant la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), nous présentons une méthode d’isolement intestinal de larves 5 jours après la fécondation (dpf) pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) (Figure 1).

Protocol

Tous les élevages et expériences de poissons-zèbres ont été menés conformément aux directives institutionnelles du programme Erasmus MC et à la législation sur le bien-être animal. L’utilisation de larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation entre dans la catégorie des expériences qui ne nécessitent pas d’approbation éthique formelle, comme le prévoit la réglementation néerlandaise. 1. Obtention de 5 jours après la fécondation (dpf) larves de type sauva…

Representative Results

Grâce à ce protocole, nous avons réussi à isoler et à dissocier des intestins entiers de 5 larves dpf. En utilisant la papaïne comme enzyme de dissociation, nous avons considérablement amélioré la viabilité cellulaire, permettant la capture de 46 139 événements impliquant des cellules uniques et viables (6,4 % de toutes les cellules) sur 244 intestins isolés (Figure 2A). Des larves entières de type sauvage ont été utilisées comme témoin pour s’assurer que le processus de …

Discussion

Nous présentons ici une méthode d’isolement et de dissociation de l’intestin de 5 larves de poisson-zèbre dpf à l’aide de FACS. Grâce à cette méthode, différents types de cellules intestinales ont été collectés et analysés avec succès par scRNA-seq, à l’aide de la plateforme 10x Genomics Chromium. Nous avons sélectionné la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), car nous voulions une indication que les cellules ENS viables seraient également isolées (Figure 2D<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par les amis de la Fondation Sophia (SSWO WAR-63).

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) Sigma 59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
Agarose Sigma-Aldrich A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap BD Biosciences 352054
Cell Ranger v3.0.2 10X Genomics N/A
DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542
Dissection microscope Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine BD Biosciences N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2 Gibco 14025050
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
L-Cysteine Sigma C7352
MS-222, Tricaine Supelco A5040-250G
Papain Sigma P4762
Seurat v3 Stuart et al. (2019) N/A
Trypan blue  Sigma  Cat#T8154

Riferimenti

  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Biologia dello sviluppo. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
  22. Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).

Play Video

Citazione di questo articolo
Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E., Bindels, E., Zink, J. T. M., Vermeulen, M., Melotte, V., Alves, M. M. Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (201), e65876, doi:10.3791/65876 (2023).

View Video