Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리
Summary
여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.
Abstract
위장관(GI)은 생명에 필수적인 다양한 기능을 수행합니다. 발달에 영향을 미치는 선천적 결함은 장 신경근 장애로 이어질 수 있으며, 이는 위장 발달 및 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. 이 연구에서는 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하여 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq) 분석에 사용할 수 있는 살아 있는 생존 가능한 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 장의 수동 해부 후 파파인과의 효소 해리를 기반으로 합니다. 그 후, 세포를 형광 활성화 세포 분류에 제출하고 scRNA-seq를 위해 생존 가능한 세포를 수집합니다. 이 방법을 통해 상피, 기질, 혈액, 근육 및 면역 세포와 장 신경 세포 및 신경교세포를 포함한 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 식별할 수 있었습니다. 따라서 제브라피시를 사용하여 건강과 질병에서 위장관의 구성을 연구하는 데 귀중한 자료라고 생각합니다.
Introduction
위장관(GI)은 전반적인 건강과 웰빙에 중요한 역할을 하는 복잡한 시스템입니다. 그것은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 노폐물 1,2의 제거를 담당합니다. 위장관은 상피세포, 평활근세포, 면역세포, 장신경계(ENS) 등 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 이들은 서로 긴밀하게 소통하여 적절한 장 기능을 조절하고 유지합니다 3,4,5. 위장관 발달의 결함은 영양소 흡수, 미생물군 구성, 장-뇌 축 및 ENS와 같은 다양한 측면에 광범위한 영향을 미칠 수 있으며, 히르슈스프룽 병(Hirschsprung disease) 및 만성 장 가성 폐쇄(Chronic intestinal pseudo-obstruction)와 같은 여러 장 신경근 장애를 유발할 수 있습니다 6,7. 이러한 장애는 Cajal의 간질 세포, 평활근 세포 및 ENS 6,8,9와 같은 다양한 주요 세포의 변화로 인한 심각한 장 운동성 장애를 특징으로 합니다. 그러나 위장 발달과 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.
제브라피쉬는 빠른 배아 발달, 배아 및 유충 단계의 투명성, 유전적 다루기 쉬움으로 인해 위장 발달 및 기능 장애를 연구하는 데 귀중한 모델 유기체입니다 10,11,12,13,14. 형광 단백질을 발현하는 수많은 형질전환 제브라피시 계통을 사용할 수 있습니다. 이러한 계통의 예로는 장 뉴런을 포함한 모든 phox2bb+ 세포가15,16으로 표지되어 있기 때문에 ENS를 연구하는 데 일반적으로 사용되는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시가 있습니다. 여기에서는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 사용하여 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 분석을 위한 수정 후 5일(dpf) 유충의 장 분리 방법을 제시합니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 FACS를 사용하여 5dpf 제브라피시 유충의 내장을 분리하고 해리하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 통해 10x Genomics Chromium 플랫폼을 사용하여 scRNA-seq로 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 수집 및 분석했습니다. 우리는 생존 가능한 ENS 세포도 분리할 수 있다는 징후를 원했기 때문에 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 선택했습니다(그림 2D). 그러나 이 방법은 신?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 소피아 재단(SSWO WAR-63)의 친구들이 자금을 지원했습니다.
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
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