Выделение кишечника из личинок данио-рерио для секвенирования одноклеточной РНК
Summary
Здесь мы опишем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для анализа секвенирования РНК одной клетки.
Abstract
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) выполняет ряд функций, необходимых для жизни. Врожденные дефекты, влияющие на его развитие, могут привести к нервно-мышечным расстройствам кишечника, что подчеркивает важность понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для получения живых, жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Этот протокол основан на ручном рассечении кишечника данио-рерио с последующей ферментативной диссоциацией папаином. Затем клетки подвергают флуоресцентно-активированной клеточной сортировке, а жизнеспособные клетки отбирают для scRNA-seq. С помощью этого метода мы смогли успешно идентифицировать различные типы кишечных клеток, включая эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные и иммунные клетки, а также кишечные нейроны и глию. Поэтому мы считаем его ценным ресурсом для изучения состава желудочно-кишечного тракта в норме и при заболеваниях, используя рыбок данио.
Introduction
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) — это сложная система, которая играет жизненно важную роль в общем здоровье и благополучии. Он отвечает за переваривание и усвоение питательных веществ, а также за выведение продуктов жизнедеятельности 1,2. Желудочно-кишечный тракт состоит из нескольких типов клеток, включая эпителиальные клетки, гладкомышечные клетки, иммунные клетки и энтеральную нервную систему (ЭНС), которые тесно взаимодействуют друг с другом, регулируя и поддерживая надлежащую функцию кишечника 3,4,5. Дефекты развития желудочно-кишечного тракта могут иметь далеко идущие последствия для различных аспектов, таких как всасывание питательных веществ, состав микробиоты, ось кишечник-мозг и ЭНС, приводя к ряду кишечных нервно-мышечных заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга и хроническая кишечная псевдообструкция 6,7. Эти расстройства характеризуются тяжелой дисмоторикой кишечника, вызванной изменениями в различных ключевых клетках, таких как интерстициальные клетки Кахаля, гладкомышечные клетки и ENS 6,8,9. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта, до сих пор плохо изучены.
Рыбка данио-рерио является ценным модельным организмом для изучения развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта благодаря своему быстрому эмбриональному развитию, прозрачности на эмбриональной и личиночной стадиях, а также генетической трактовке 10,11,12,13,14. Существуют многочисленные трансгенные линии данио-рерио, экспрессирующие флуоресцентные белки. Примером такой линии является рыбка данио-рерио tg(phox2bb:GFP), обычно используемая для изучения ЭНС, поскольку все клетки phox2bb+, включая энтеральные нейроны, помечены15,16. Здесь, используя линию данио-рерио tg(phox2bb:GFP), мы представляем метод кишечной изоляции личинок через 5 дней после оплодотворения (dpf) для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе мы представляем метод выделения и диссоциации кишечника личинок данио-рерио 5 dpf с использованием FACS. С помощью этого метода различные типы клеток кишечника были успешно собраны и проанализированы с помощью scRNA-seq с использованием платформы 10x Genomics Chromium. Мы выбрали линию ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Фондом друзей Софии (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
Riferimenti
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Biologia dello sviluppo. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
