Tarmisolering från zebrafisklarver för encells-RNA-sekvensering
Summary
Här beskriver vi en metod för tarmisolering från zebrafisklarver 5 dagar efter befruktning, för encellig RNA-sekvenseringsanalys.
Abstract
Mag-tarmkanalen (GI) utför en rad funktioner som är viktiga för livet. Medfödda defekter som påverkar dess utveckling kan leda till enteriska neuromuskulära störningar, vilket understryker vikten av att förstå de molekylära mekanismerna bakom GI-utveckling och dysfunktion. I denna studie presenterar vi en metod för tarmisolering från zebrafisklarver 5 dagar efter befruktning för att få levande, livskraftiga celler som kan användas för encells-RNA-sekvensering (scRNA-seq) analys. Detta protokoll är baserat på manuell dissektion av zebrafiskens tarmar, följt av enzymatisk dissociation med papain. Därefter underkastas cellerna fluorescensaktiverad cellsortering, och livsdugliga celler samlas in för scRNA-seq. Med denna metod kunde vi framgångsrikt identifiera olika celltyper i tarmen, inklusive epitel-, stroma-, blod-, muskel- och immunceller, samt enteriska nervceller och gliaceller. Därför anser vi att det är en värdefull resurs för att studera mag-tarmkanalens sammansättning vid hälsa och sjukdom, med hjälp av zebrafisken.
Introduction
Mag-tarmkanalen (GI) är ett komplext system som spelar en viktig roll för den allmänna hälsan och välbefinnandet. Det är ansvarigt för matsmältningen och absorptionen av näringsämnen samt eliminering av avfallsprodukter 1,2. Mag-tarmkanalen består av flera celltyper, inklusive epitelceller, glatta muskelceller, immunceller och det enteriska nervsystemet (ENS), som kommunicerar nära varandra för att reglera och upprätthålla korrekt tarmfunktion 3,4,5. Defekter i utvecklingen av mag-tarmkanalen kan ha långtgående effekter på olika aspekter såsom näringsupptag, mikrobiotasammansättning, tarm-hjärna-axeln och ENS, vilket leder till flera enteriska neuromuskulära sjukdomar, såsom Hirschsprungs sjukdom och kronisk intestinal pseudoobstruktion 6,7. Dessa sjukdomar kännetecknas av allvarlig tarmdysmotilitet orsakad av förändringar i olika nyckelceller, såsom de interstitiella cellerna i Cajal, glatta muskelceller och ENS 6,8,9. De molekylära mekanismerna bakom GI-utveckling och dysfunktion är dock fortfarande dåligt kända.
Zebrafisken är en värdefull modellorganism för att studera utveckling och dysfunktion av mag-tarmkanalen på grund av dess snabba embryonala utveckling, transparens under embryonala och larvstadier och genetisk spårbarhet 10,11,12,13,14. Det finns ett stort antal transgena zebrafisklinjer som uttrycker fluorescerande proteiner. Ett exempel på en sådan linje är tg(phox2bb:GFP) zebrafisken, som vanligtvis används för att studera ENS, eftersom alla phox2bb+-celler, inklusive enteriska neuroner, är märkta15,16. Här, med hjälp av tg(phox2bb:GFP) zebrafisklinjen, presenterar vi en metod för tarmisolering av 5 dagar efter befruktning (dpf) larver för encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) analys (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi en metod för isolering och dissociation av tarmen hos 5 dpf zebrafisklarver med hjälp av FACS. Med denna metod har olika tarmcelltyper framgångsrikt samlats in och analyserats med scRNA-seq, med hjälp av 10x Genomics Chromium-plattformen. Vi valde tg(phox2bb:GFP) zebrafisklinjen, eftersom vi ville ha en indikation på att livskraftiga ENS-celler också skulle isoleras (Figur 2D). Det är dock viktigt att notera att denna metod lätt kan utvidgas till andra ze…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Sophia Foundations vänner (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
Riferimenti
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Biologia dello sviluppo. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
