ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T
Summary
פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.
Abstract
טיפולים תאיים מהונדסים המשתמשים בתאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T השיגו יעילות יוצאת דופן באנשים עם ממאירויות המטולוגיות ונמצאים כעת בפיתוח לטיפול בגידולים מוצקים מגוונים. עד כה, ההערכה הראשונית של תוצרי תאי CAR-T חדשים התרחשה בעיקר במודלים של גידולי קסנוגרפט באמצעות עכברים מדוכאי חיסון. גישה זו נבחרה כדי להקל על קליטה מוצלחת של תאי CAR-T אנושיים בסביבה הניסויית. עם זאת, מודלים סינגניים של עכברים, שבהם גידולים ותאי CAR-T נגזרים מאותו זן עכבר, מאפשרים הערכה של טכנולוגיות CAR חדשות בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת ומיקרו-סביבה מקיפה של הגידול (TME). הפרוטוקול המתואר כאן נועד לייעל את תהליך ייצור תאי CAR-T בעכבר על ידי הצגת שיטות סטנדרטיות להתמרה רטרו-ויראלית ולתרבית תאי T ex vivo . השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות על מבני CAR אחרים מעבר לאלה המשמשים במחקר זה כדי לאפשר הערכה שגרתית של טכנולוגיות CAR חדשות במערכות הכשירות למערכת החיסון.
Introduction
טיפולים מאומצים בתאי T המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) חוללו מהפכה בתחום האימונותרפיה לסרטן על ידי רתימת כוחה של מערכת החיסון הנרכשת כדי להתמקד ספציפית בתאי סרטן חיוביים לאנטיגןולחסל אותם 1. בעוד ההצלחה של טיפולים בתאי CAR-T המכוונים לממאירויות של תאי B אוששה קלינית, מחקרים פרה-קליניים שבוצעו במודלים של בעלי חיים נותרו חיוניים לפיתוח CARs חדשים המכוונים לגידולים מוצקים. עם זאת, יעילות קלינית מוגבלת הוכחה באינדיקציות גידול מוצקות עד כה, ומתברר יותר ויותר כי מודלים פרה-קליניים בודדים אינם מנבאים במדויק את הפרמקודינמיקה והיעילות הקלינית של תרופה חיה 2,3. לכן, החוקרים החלו להרחיב את המחקר הפרה-קליני של תוצרי תאי CAR-T כך שיכלול הערכות מקבילות בקסנוגרפט ובמודלים סינגניים של סרטן אנושי וסרטן מורין, בהתאמה.
בניגוד למודלים של קסנוגרפט, שבהם גידולים אנושיים ותאי T מושתלים בעכברים מדוכאי חיסון, מודלים סינגניים מאפשרים לבחון תגובות של תאי CAR-T בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת. באופן ספציפי, עכברים בעלי כשירות חיסונית הנושאים גידולים סינגניים מספקים מערכת לחקר האינטראקציה בין תאי T שהועברו באופן מאומץ לבין מילייה ספציפי להקשר – כולל מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ותאי T רגולטוריים (Tregs) הידועים כמדכאים את תפקוד תאי T במיקרו-סביבה של הגידול (TME)4,5,6. יתר על כן, מודלים סינגניים מציעים פלטפורמה נוספת להערכת רעילות ממוקדת, מחוץ לגידול, ואינטראקציה של תאי CAR-T עם גורמים מארחים שעלולים להוביל לרעילות נוספת, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים7.
למרות יתרונות אלה, מספר המחקרים הסינגניים בתאי CAR-T נותר מוגבל. יש לציין כי מודלים סינגניים דורשים הנדסה אוטולוגית של תאי CAR-T מאותו זן עכבר ולכן מהווים אתגר נוסף בשל היעדר מתודולוגיה להתמרה יעילה של תאי T מורין והרחבת ex vivo 2,8. פרוטוקול זה מתאר את השיטות להשגת ביטוי CAR יציב באמצעות ייצור וקטורים רטרו-ויראליים והתמרה אופטימלית של תאי T. סכמה של התהליך כולו מוצגת באיור 1. השימוש בגישה זו מדגים התמרה רטרו-ויראלית יעילה של תאי CAR-T מורין והשגת ביטוי CAR גבוה ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. אסטרטגיות לשינוי ספציפיות האנטיגן של מבנה CAR נדונות בנוסף לביטוי משותף של טרנסגנים נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השלבים והריאגנטים הדרושים להתמרה רטרו-ויראלית של תאי T מורין כדי ליצור תאי CAR-T עבור מחקרי in vivo . אופטימיזציה של תנאי התמרה רטרו-ויראלית משיגה ביטוי CAR חזק ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה או ריאגנטים נוספים. עם זאת, ישנם שינויים מרובים שניתן ליישם על מת…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לל. ברוקמן על הביקורת על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01EB030352 ו- UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
