Génération efficace de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) murin
Summary
Ce protocole rationalise la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T murins, facilitant ainsi la génération efficace de cellules CAR-T chez la souris.
Abstract
Les thérapies cellulaires modifiées utilisant des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR)-T ont atteint une efficacité remarquable chez les personnes atteintes d’hémopathies malignes et sont actuellement en cours de développement pour le traitement de diverses tumeurs solides. Jusqu’à présent, l’évaluation préliminaire de nouveaux produits cellulaires CAR-T a principalement eu lieu dans des modèles tumoraux de xénogreffe utilisant des souris immunodéficientes. Cette approche est choisie pour faciliter la prise de greffe réussie de cellules CAR-T humaines dans le cadre expérimental. Cependant, les modèles murins syngéniques, dans lesquels les tumeurs et les cellules CAR-T sont dérivées de la même souche de souris, permettent d’évaluer les nouvelles technologies CAR dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel et d’un microenvironnement tumoral complet (TME). Le protocole décrit ici vise à rationaliser le processus de génération de cellules CAR-T chez la souris en présentant des méthodes standardisées pour la transduction rétrovirale et la culture ex vivo de cellules T. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions de CAR au-delà de celles utilisées dans cette étude pour permettre l’évaluation de routine de nouvelles technologies de CAR dans les systèmes immunocompétents.
Introduction
Les thérapies adoptives à base de lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ont révolutionné le domaine de l’immunothérapie du cancer en exploitant la puissance du système immunitaire adaptatif pour cibler et éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses antigéniques positives1. Bien que le succès des thérapies cellulaires CAR-T ciblant les tumeurs malignes à cellules B ait été validé cliniquement, les études précliniques réalisées sur des modèles animaux restent vitales pour le développement de nouvelles thérapies CAR-T ciblant les tumeurs solides. Cependant, une efficacité clinique limitée a été démontrée jusqu’à présent dans les indications de tumeurs solides, et il devient de plus en plus évident que les modèles précliniques individuels ne prédisent pas avec précision la pharmacodynamie et l’efficacité clinique d’un médicament vivant 2,3. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à élargir l’étude préclinique des produits cellulaires CAR-T pour inclure des évaluations parallèles dans des modèles xénogreffiques et syngéniques de cancers humains et murins, respectivement.
Contrairement aux modèles de xénogreffe, où les tumeurs humaines et les lymphocytes T sont greffés dans des souris immunodéficientes, les modèles syngéniques permettent d’examiner les réponses des cellules CAR-T dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel. Plus précisément, les souris immunocompétentes porteuses de tumeurs syngéniques fournissent un système permettant d’étudier l’interaction entre les lymphocytes T transférés par adoption et les milieux spécifiques au contexte, y compris les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) connus pour supprimer la fonction des lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral (ETM4,5,6). De plus, les modèles syngéniques offrent une plate-forme supplémentaire pour évaluer la toxicité sur cible, hors tumeur, et l’interaction des cellules CAR-T avec les facteurs de l’hôte qui peuvent conduire à des toxicités supplémentaires, y compris le syndrome de libération de cytokines7.
Malgré ces avantages, le nombre d’études sur les cellules CAR-T syngéniques reste limité. Notamment, les modèles syngéniques nécessitent l’ingénierie autologue de cellules CAR-T de la même souche de souris et présentent donc un défi supplémentaire en raison de l’absence de méthodologie pour une transduction efficace des cellules T murines et une expansion ex vivo 2,8. Ce protocole décrit les méthodes permettant d’obtenir une expression stable de CAR grâce à la production de vecteurs rétroviraux et à l’optimisation de la transduction des lymphocytes T. Un schéma de l’ensemble du processus est présenté à la figure 1. L’utilisation de cette approche démontre l’efficacité de la transduction rétrovirale des cellules CAR-T murines et l’obtention d’une expression élevée de CAR sans avoir besoin d’une concentration virale par ultracentrifugation. Des stratégies visant à modifier la spécificité antigénique de la construction CAR sont discutées en plus de la co-expression de transgènes supplémentaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit les étapes et les réactifs nécessaires à la transduction rétrovirale des lymphocytes T murins afin de générer des lymphocytes CAR-T pour des études in vivo . L’optimisation des conditions de transduction rétrovirale permet d’obtenir une expression robuste de la CAR sans avoir besoin d’une concentration virale par ultracentrifugation ou réactifs supplémentaires. Cependant, il existe de multiples modifications qui peuvent être appliquées à cette méthodologie.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions L. Brockmann pour la relecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par NIH 1R01EB030352 et UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
Riferimenti
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