Summary
Настоящий протокол описывает хирургическую технику имплантации электродной решетки в брюшной блуждающий нерв у крыс, а также методы хронического электрофизиологического тестирования и стимуляции с помощью имплантированного устройства.
Abstract
Стимуляция блуждающего нерва брюшной полости (ВНС) может быть применена к поддиафрагмальной ветви блуждающего нерва крыс. Благодаря своему анатомическому расположению, он не имеет каких-либо побочных эффектов со стороны дыхательных и сердечных органов, обычно связанных с ВНС шейного отдела. Отсутствие побочных эффектов со стороны дыхательных и сердечных органов означает, что интенсивность стимуляции не нужно снижать, чтобы уменьшить побочные эффекты, обычно возникающие во время ВНС шейного отдела. Несколько недавних исследований демонстрируют противовоспалительные эффекты ВНС брюшной полости на крысиных моделях воспалительных заболеваний кишечника, ревматоидного артрита и снижение гликемии на крысиной модели диабета 2 типа. Крыса является отличной моделью для изучения потенциала этой технологии из-за хорошо установленной анатомии блуждающего нерва, большого размера нерва, который позволяет легко с ним обращаться, и доступности многих моделей заболеваний. В данной статье мы опишем методы очистки и стерилизации электродной решетки VNS брюшной полости и хирургический протокол у крыс. Описана технология, необходимая для подтверждения надпороговой стимуляции путем регистрации вызванных потенциалов действия соединений. ВНС брюшной полости обладает потенциалом для обеспечения селективного и эффективного лечения различных состояний, включая воспалительные заболевания, и ожидается, что его применение будет расширяться аналогично ВНС шейного отдела.
Introduction
Стимуляция блуждающего нерва (VNS), проводимая в шейном отделе шеи, одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения рефрактерной эпилепсии, рефрактерной депрессиии реабилитации после ишемического инсульта1 и одобрена Европейской комиссией для лечения сердечной недостаточности в Европе2. Неинвазивная ВНС шейки матки одобрена FDA для лечения мигрени и головной боли1. Ожидается, что его применение будет расширяться, поскольку недавние клинические испытания показали эффективность VNS при других показаниях, таких как болезнь Крона3, ревматоидный артрит 4,5 и нарушение толерантности к глюкозе и диабет 2 типа 6,7. Несмотря на многообещающие перспективы, ВНС шейного отдела позвоночника может вызывать брадикардию и апноэ из-за нецелевой активации нервных волокон, которые иннервируют легкие и сердце 8,9,10. Побочные эффекты, такие как кашель, боль, изменение голоса, головная боль и повышение индекса апноэ-гипопноэ, обычно регистрируются у пациенток, получающих ВНСшейного отдела позвоночника 11,12. Снижение силы стимуляции является распространенной стратегией для уменьшения этих побочных эффектов, однако снижение заряда может ограничить эффективность терапии ВНС, не активируя терапевтические волокна11. В поддержку этой гипотезы говорит тот факт, что частота ответа пациентов, получавших стимуляцию высокой интенсивности для лечения эпилепсии, была выше, чем у пациентов, получавших стимуляцию низкой интенсивности13.
ВНС брюшной полости накладывается на субдиафрагмальный блуждающий нерв, над печеночной и чревной ветвями14 (рис. 1). Наше предыдущее исследование показало, что у крыс абдоминальная ВНС не вызывает сердечных или респираторных побочных эффектов, связанных с ВНСшейки матки 10. Более ранние исследования также демонстрируют противовоспалительные эффекты ВНС брюшной полости на крысиной модели воспалительного заболевания кишечника и ревматоидного артрита10,15, а также снижение гликемии у крыс с моделью диабета 2 типа16. Недавно технология абдоминальной ВНС была переведена на первое клиническое испытание на людях для лечения воспалительных заболеваний кишечника (NCT05469607).
Электродная решетка периферических нервов, используемая для стимуляции блуждающего нерва брюшной полости (WO201909502017), была специально разработана для использования на крысах и состоит из двух-трех пар платиновых электродов, расположенных на расстоянии 4,7 мм друг от друга, поддерживаемых манжетой из медицинского силиконового эластомера, шовного язычка для фиксации решетки в пищеводе, свинцового провода и чрескожного соединителя для установки в поясничной области (рис. 2). Свинцовая проволока прокладывается под кожей с левой стороны животного. Конструкция из нескольких пар электродов позволяет проводить электрическую стимуляцию нерва, а также регистрировать электрически вызванные сложные потенциалы действия (ECAP), что подтверждает правильность установки имплантата на нерв и интенсивность надпороговой стимуляции. Абдоминальная ВНС хорошо переносится у свободно движущихся крыс в течение 10,15,16 месяцев. Это позволяет оценить его эффективность на моделях заболеваний.
В данной статье описаны методы стерилизации электродной решетки, операции по имплантации блуждающего нерва брюшной полости, а также хронической стимуляции и регистрации ECAP у бодрствующих крыс для изучения эффективности ВНС брюшной полости при различных моделях заболеваний. Эти методы были первоначально разработаны для изучения эффективности ВНС брюшной полости на крысиной модели воспалительного заболевания кишечника10 , а также были успешно использованы для крысиной модели ревматоидного артрита15 и диабета16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по этике животных больницы Святого Винсента (Мельбурн) и соответствовали Австралийскому кодексу по уходу и использованию животных в научных целях (Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии) и Закону о предотвращении жестокого обращения с животными (1986 г.). Всего для исследования было использовано 24 самки крыс темной породы Агути (в возрасте 8-9 недель). Экспериментальные группы состояли из: нормальной когорты (n = 8), не получавшей инъекции коллагена или имплантата VNS; когорта нестимулированного заболевания (n = 8), получившая имплантат и инъекцию коллагена (электрофизиологические тесты не проводились); и когорта со стимулированным заболеванием (n = 8), получившая имплантат, инъекцию коллагена, электрофизиологическое тестирование и терапию VNS. Операция по имплантации проводилась за 5 дней до инъекции коллагена, а привыкание к терапии ВНС начиналось через 4 дня после инъекции коллагена и происходило в течение 7 дней. Терапию ВНС проводили с 11 по 17 день (включительно) послеинъекции коллагена на 15 день. Для когорты со стимулированным заболеванием электрофизиологическое тестирование проводили сразу после операции по имплантации под наркозом, в день инъекции коллагена, через 10 дней после инъекции коллагена и в день прекращения (через 17 дней после инъекции коллагена).
1. Ультразвуковая обработка и стерилизация электродной решетки
- Установите ультразвуковой очиститель на частоту 80 кГц и наполните ультразвуковой резервуар водопроводной водой. Погрузите электродную решетку в чистящий раствор в чистую пластиковую емкость и поместите ее в ультразвуковой резервуар.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чистящий раствор и время ультразвуковой обработки, используемые для каждого этапа, приведены в таблице 1. Используйте чистую емкость для каждого шага. - Поместите массив электродов с ультразвуковой обработкой в стерилизационный пакет с помощью чистых щипцов, обработанных 0,5% жидким чистящим раствором в дистиллированной воде и промытых в дистиллированной воде. Электродную решетку автоклавировать в течение 45 минут при максимальной температуре 130 °C и дать ей высохнуть на чистом столе.
2. Имплантация электродной решетки на брюшной блуждающий нерв
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали самок темных крыс агути (в возрасте 8-9 недель)15. Мы также успешно использовали этот протокол для хронической имплантации взрослых самцов крыс Спрэга-Доули (в возрасте 10-14 недель)10,16. Операция проводится в асептических условиях, а все инструменты, электродная решетка и расходные материалы, такие как марля и ватные наконечники, стерилизуются автоклавированием.
- Обезболивайте крысу в индукционной камере, используя 3% изофлуран и 1 л/мин кислорода. Если педальный рефлекс на защемление пальцев ног отсутствует, переместите крысу на нагревательный коврик с термостатом на операционном столе и наденьте на нос изофлурановую маску.
- Контролируйте частоту дыхания и температуру прямой кишки на протяжении всей операции и регулируйте уровень изофлурана в диапазоне от 1,5% до 2,5%, чтобы поддерживать частоту дыхания в пределах от 40 до 62 вдохов в минуту. При необходимости отрегулируйте настройки нагревательного коврика, чтобы поддерживать диапазон ректальной температуры в пределах 35,9–37,5 °C.
- Перед началом операции ввести предварительно обезболивающее средство подкожно с помощью шприцев по 1 мл с иглами 25G (карпрофен 5 мг/кг и бупренорфин 0,03 мг/кг подкожно).
- Обильно побрейтесь вокруг места разреза, включая область вдоль вентральной срединной линии от ксифоидного отростка до конца грудной клетки, поясничную сторону спины вдоль дорсальной средней линии и левую сторону тела между передней и задней конечностями, чтобы обеспечить подкожное туннелирование массива.
- Очистите места хирургического вмешательства круговыми движениями три раза, чередуя бетадин и спирт, и накройте животное хирургической простыней. Вводят бупивакаин (1-2 мг/кг) подкожно с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 25G в местах дорсального и вентрального разрезов.
- Поместите животное в брюшное лежачее положение и сделайте надрез длиной 2 см на спине, где чрескожный пьедестал будет закреплен с помощью лезвия скальпеля.
- Переверните крысу в спинное положение лежа и сделайте 3-сантиметровый разрез на коже по средней линии чуть ниже ксифовидного отростка с помощью лезвия скальпеля. Прижмите кожу к месту разреза и с помощью ножниц для рассечения тупым образом рассеките слой кожи от мышечного слоя вокруг разреза.
- Чтобы обеспечить подкожное туннелирование массива от пьедестала до места имплантации, уложите животное на правый бок, введите гемостат из вентрального разреза и тупым рассечением по направлению к месту дорсального разреза. Отрежьте край колпачка иглы и вставьте электродную решетку, чтобы защитить ее во время транспортировки (Рисунок 1B). Руками (наденьте стерильные перчатки) туннелируйте электродную решетку под кожу по направлению к вентральному разрезу.
- Чтобы получить доступ к пищеводу и блуждающему нерву, снова уложите животное в спинное лежачее положение. Сделайте разрез 3 см на мышечном слое по средней линии ниже ксифоидного отростка, достаточно большой, чтобы обнажить всю длину печени. Избегайте повреждения печени на этом этапе.
- Сделайте меньший разрез (менее 1 см) на мышечном слое сбоку (с левой стороны животного) к основному вентральному разрезу. Туннелируйте электродную решетку через этот небольшой разрез с помощью колпачка иглы, используемого на шаге 2.8, чтобы ввести решетку в брюшную полость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг уменьшает напряжение, приложенное к основному месту разреза, и снижает риск разрыва швов. - Втяните слои кожи и мышц, чтобы сохранить брюшную полость открытой. Следите за тем, чтобы салфетки оставались влажными, используя ватные наконечники и марлю, смоченную в стерильном физиологическом растворе.
- Осторожно втяните печень, разрезав соединительную ткань вокруг нее ножницами Vannas и наложив ретрактор на небольшой кусочек марли, смоченной в физиологическом растворе для защиты. Осторожно втяните желудок, чтобы обеспечить выпрямление пищевода и вышележащего блуждающего нерва, поместив ретрактор между пищеводом и желудком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Втягивающие устройства изготавливаются путем закругления заостренного конца рыболовных крючков. - После обнажения вентральной поверхности пищевода определите блуждающий нерв брюшной полости и его подветви, включая печеночный нерв, чревный нерв и две желудочные ветви (рис. 1D).
- Разрежьте соединительную ткань, прикрепляющую блуждающий нерв брюшной полости к пищеводу, с помощью тонких щипцов и ножниц Ванна и рассеките нерв по длине чуть выше печеночной и чревной ветвей по направлению к диафрагме. Следите за тем, чтобы не порвать, не растянуть и не защемить нерв. Поместите электродную решетку рядом с нервом, чтобы убедиться, что нерв отделен от соединительной ткани достаточной длины, чтобы поместиться в решетку.
- После того, как соединительная ткань будет очищена вокруг нерва, пропустите шелковые швы (7-0) на стороне электрода манжеты решетки под нервом. Расстегните манжету массива и осторожно поместите нерв в канал массива.
- Убедитесь, что нерв по всей длине находится внутри канала массива. Завяжите швы вокруг манжеты вместе, чтобы надежно закрыть манжету и убедиться, что нерв не выскользнет из канала. Обрежьте швы.
- Используя шелковый шов 7-0, пришовите язычок решетки к пищеводу, чтобы закрепить решетку на месте и предотвратить ее скручивание. Избегайте повреждения других ветвей блуждающего нерва или введения иглы слишком глубоко в гладкую мышцу пищевода.
- Аккуратно снимите ретракторы и убедитесь, что вся марля удалена из брюшной полости. Введите 1-2 мл теплого стерильного физиологического раствора с помощью шприца объемом 1 мл в брюшную полость и переместите печень в правильное положение.
- Закройте мышечный слой шелковым швом 3-0, используя простую технику бегущего шва, сделав надежные квадратные узлы не менее чем с 3 бросками на обоих концах. Пространственные швы плотно прилегают друг к другу (примерно 3 мм друг от друга) для предотвращения осложнений, таких как грыжа/выпячивание ксифовидного отростка.
- Используйте шов, чтобы закрыть разрез брюшины вместе с разрезом мышечного слоя, чтобы уменьшить вероятность склеивания тканей.
- Используя рассасывающийся шовный материал (Vicryl 4-0), закройте разрез кожи. Используйте скрытую технику наложения швов, такую как вертикальный шов матраса с бегущим углубленным матрасом или бегущий скрытый кожный шов, чтобы животное не сняло шов.
- Поверните животное в вентральное положение лежа и с помощью ножниц удлините дорсальный разрез до 4-5 см и рассеките тупым слоем между мышцей и слоем кожи дальше, чтобы соединительное основание чрескожного соединителя могло сидеть ровно на мышечном слое.
- Используя шелковый шов 3-0, сделайте от 6 до 8 простых прерывистых швов вокруг основания соединителя, чтобы закрепить его на мышечном слое под ним. Закройте разрез кожи шелковым швом 3-0, используя технику горизонтального матрасного шва, обеспечив надежные квадратные узлы не менее чем за 3 броска.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе предпочтение отдается плетеным шелковым шовным нитям из-за их простоты в обращении и способности создавать более надежные узлы по сравнению с монофиламентными нитями. - По окончании операции раствор Хартмана вводят подкожно (1 мл/100 г/ч). Выключите изофлуран и дайте животному восстановиться на нагревательном коврике при подаче кислорода (1,5 л/мин). Как только крыса будет в сознании и полностью подвижна, верните ее в домашнюю клетку, положив на грелку, до полного выздоровления от анестетика.
- Внимательно наблюдайте за восстановлением животного после изофлурана и убедитесь, что животное может получить доступ к еде и питью. В последующие два дня обеспечьте подкожное введение послеоперационного обезболивания (карпрофен 5 мг/кг, ежедневно) для облегчения боли. Наблюдайте за животным не реже 2 раз в день и проверяйте наличие признаков дефекации, качество шерсти, уровень активности и наличие отека или выделений из операционных ран.
- Рекордный вес животного, а в редких случаях животное теряет 10% и более, начинают интенсивное лечение. Интенсивное лечение включает в себя подкожное введение жидкостей (раствор Хартманна, 2 шт. по 10 мл) каждый день, предоставление дополнительного питания, такого как свежие овощи и пищевые гелевые добавки, а также помещение половины клетки на грелку с термостатом для дополнительного тепла. Увеличивайте частоту наблюдения до тех пор, пока животное не выздоровеет. При необходимости продолжайте принимать обезболивающее средство (карпрофен 5 мг/кг, SQ, ежедневно) по шкале Гримаса.
3. Электрофизиологическое тестирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Регистрация вызванных композитных потенциалов действия (ECAP) подтверждает правильное размещение электродной решетки на блуждающем нерве. Кроме того, регистрация ECAP с помощью описанной выше электродной решетки дает вероятное подтверждение электрической активации вагусных С-волокон и надпороговых VNS10,15.
- Измерьте общее сопротивление заземления электродов, чтобы оценить их целостность и обнаружить обрывы или короткие замыкания проводов перед записью ECAP. Функционирующие электроды блуждающего нерва брюшной полости in vivo должны иметь значения импеданса от 4 до 20 кОм.
- Тестируйте животных под наркозом, т.е. сразу после операции, или в бодрствующем состоянии и свободно двигающихся. Проведите пробуждение, по крайней мере, через 2-3 дня после операции, чтобы операционные раны кожи зажили и стабилизировались. Подберите оборудование, необходимое для импедансного и электрофизиологического тестирования, которое включает в себя изготовленный по индивидуальному заказу стимулятор, устройство сбора данных, изолированный дифференциальный усилитель и программное обеспечение для сбора и анализа данных, как указано в таблице материалов.
- При необходимости заверните животное в полотенце, подсоедините кабель к заднему чрескожному разъему, а другой конец кабеля подсоедините к стимулятору. Чтобы проверить общее сопротивление заземления электродов, подайте импульсы двухфазного тока (100 мкс на фазу и ток 107 мкА) между интересующим электродом и всеми остальными электродами на решетке.
- Измерьте пиковое напряжение в конце первой фазы сигнала напряжения (всего вольт) и рассчитайте полное сопротивление (всего Z) по закону Ома (Z = напряжение/ток).
- Подключите пару электродов к стимулятору и пару электродов к регистрирующему оборудованию и примените биполярную стимуляцию для генерации ECAP с использованием электрода сравнения имплантата VNS, помещенного под кожу, в качестве эталона для дифференциальной регистрации ECAP. Сделайте два набора записей, усредненных из 50 повторений, используя программное обеспечение для сбора и анализа данных.
- Для измерений используйте следующие настройки.
Токи: от 0 до 2 мА с шагом 0,1 мА;
Длительность импульса: 25 - 200 мкс;
Межфазный зазор: 8 - 50 мкс;
Частота стимуляции: 10 - 30 импульсов/с;
Частота дискретизации: 100 кГц;
Фильтр: верхние частоты 200 Гц, низкие частоты 2000 Гц, коэффициент усиления по напряжению 1 x 102. - Используя программное обеспечение для анализа данных, проанализируйте отклик ECAP путем измерения размаха напряжения осциллограмм в пределах окна анализа (4 - 10 мс после стимуляции, обозначенное затенением на рисунке 3A, B). Порог ECAP определяется как минимальная интенсивность стимульного тока, обеспечивающая амплитуду отклика не менее 0,1мкВ в обоих наборах записей средней электрофизиологии. Допустимый ответ будет повторяться по крайней мере для двух текущих уровней выше порогового значения и отсутствовать по крайней мере для двух текущих уровней ниже порога10,15.
4. Хроническая абдоминальная ВНС у бодрствующих крыс
ПРИМЕЧАНИЕ: Абдоминальная ВНС может быть применена к пробужденным животным после того, как хирургическая рана вокруг чрескожного соединителя заживет и стабилизируется. Чтобы уменьшить любую реакцию на стресс и обеспечить более эффективный сбор данных, животных приучают к среде обращения и стимуляции тестеров по одному часу в день в течение семи дней до операции по имплантации и начала терапии VNS.
- Измерьте импеданс каждого электрода, как описано в шаге 3.4, перед применением любого VNS. Убедитесь, что импеданс стимулирующих электродов ниже 20 кОм.
- Подсоедините кабель к заднему чрескожному разъему, а другой конец кабеля — к стимулятору, запрограммированному на соответствующую стимуляцию (например, 27 Гц, 1,6 мА, ширина импульса 200 мкс с межфазным зазором 50 мкс, 30 с ВКЛ, 2,5 мин выключение15) и включите стимулятор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что животные часто засыпают во время стимуляции, если они должным образом привыкли, по возможности используйте кабель с защитным внешним материалом, таким как стальные катушки, чтобы предотвратить его пережевывание. - Наблюдайте за животным в начале каждого сеанса терапии VNS, чтобы убедиться в отсутствии побочных реакций, таких как чрезмерный груминг или внезапное повышение/снижение уровня активности в соответствии со временем стимуляции.
- Контролируйте каждые 30 минут, чтобы проверить, не перекручивается ли или не отсоединяется кабель. Для хронического применения ВНС (например, 3 ч в день в течение 7 дней15) повторяйте шаги 4.1-4.3 в начале каждого сеанса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование коммутатора может снизить вероятность перекручивания кабелей и может потребовать менее частого мониторинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Регистрация вызванных сложных потенциалов действия (ECAP, рис. 3A, B) сразу после операции является методом, который может быть использован для подтверждения правильного расположения нерва в канале решетки, а также того, что стимуляция эффективна для активации блуждающего нерва.
На рисунке 3 самкам темных крыс агути (8-9-недельный возраст) имплантировали электродную решетку VNS. У крыс, случайным образом отобранных для получения терапевтической стимуляции, ECAP регистрировались сразу после операции (день 0, рис. 3А) и в конце сеанса терапии ВНС (23-й день, рис. 3Б). Наличие ECAP (рис. 3B) указывало на то, что интенсивность стимуляции была выше нервного порога и что нерв был успешно активирован. Животные в группе лечения ВНС исключались, если ВКАП не регистрировались, поскольку не было гарантии того, что стимуляция была успешно проведена15. Латентность нейронного ответа (рис. 3A, B, обозначена зеленой стрелкой) может быть использована для оценки того, какой класс волокон был активирован.
В предыдущих исследованиях мы наблюдали, что большинство нейронных реакций обычно происходит между 4 мс и 10 мс 10,15. Учитывая, что расстояние между стимулирующей и регистрирующей парами составляет 4,7 мм, приблизительная скорость проводимости этого окна отклика составляет 0,47 - 1,2 м/с, что согласуется со скоростью проводимости С-волокон18.
Между 0-м днем (377 мкА, рис. 3А) и 23-м днем (1335 мкА, рис. 3В) наблюдается повышение нейронного порога, которое происходит с течением времени, вероятно, из-за незначительного доброкачественного фиброза, формирующегося вокруг границы раздела ткань-электрод10,15.
На рисунке 3С показана экспериментальная испытательная установка и расположение заднего разъема, который оставался стабильным в течение 3-недельного испытательного периода15.
Рисунок 1: Участки для ВНС шейного отдела позвоночника и ВНС брюшной полости. (А) ВНС шейного отдела прикладывают выше ветвей к сердцу и дыхательным путям, а брюшного ВНС – ниже этих ветвей. (B) Электродная решетка вставляется в колпачок иглы (со снятым ободком) для защиты ее во время туннелирования под кожу. (C) Брюшная матрица VNS крысы имплантируется и фиксируется швами (D) над чревной и печеночной ветвями ниже диафрагмы. Сокращения: VN = блуждающий нерв, b. = ветвь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Крысиная матрица VNS. (A) Крысиная VNS-матрица состоит из чрескожного разъема и электродной решетки, соединенных свинцовым проводом. (B) Язычок рядом с электродной решеткой может быть пришит к пищеводу, чтобы помочь стабилизировать положение решетки. Стандартная решетка брюшного блуждающего нерва крысы поставляется с двумя парами электродов (Е1 и Е2, а также Е3 и Е4). Обе пары электродов могут использоваться как для стимуляции, так и для записи. Чрескожный коннектор монтируется на области пиломатериала животного, а подводящий провод туннелируется под кожей с левой стороны животного. Электрод сравнения вдоль провода помещается под кожу с левой стороны животного после имплантации электродной решетки. Электродная решетка имплантируется на блуждающий нерв вдоль пищевода над желудком и чуть ниже диафрагмы. (C) Дополнительная длина провода с левой стороны животного под кожей обеспечивает снятие натяжения. Сокращения: E = электрод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Типичные электрофизиологические следы, записанные из брюшного блуждающего нерва во время хронической имплантации и крысы, получающей терапию VNS. (А) Каждый электрофизиологический след представляет собой в среднем 25 повторений. Зелеными заштрихованными прямоугольниками показана типичная латентность ответа С-волокна в брюшном блуждающем нерве крысы в диапазоне от 4 мс до 10 мс (при использовании электродной решетки с расстоянием 4,7 мм между стимулирующей и регистрирующей парами электродов, от центра к центру). ECAP помечены зелеными стрелками. (Б) Крыса, получающая терапию ВНС через чрескожный коннектор на спине в домашней клетке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Чистящий раствор | Время ультразвуковой обработки |
| 1. 0,5% пиронега в сверхчистой воде | 15 мин |
| 2. Сверхчистая вода | 5 мин |
| 3. Сверхчистая вода | 5 мин |
| 4. 96% этанол | 10 мин |
| 5. Сверхчистая вода | 5 мин |
| 6. Сверхчистая вода | 5 мин |
Таблица 1: Этапы ультразвуковой обработки. В таблице приведена подробная информация о выполняемой здесь ультразвуковой обработке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод абдоминальной имплантации ВНС и хронической стимуляции блуждающего нерва и регистрации ECAP успешно применялся и хорошо переносился в течение 5 недель у крыс после имплантации 10,15,16. Ретракция желудка, печени и кишечника для получения хорошего обзора пищевода и блуждающего нерва является одним из ключевых этапов операции. Как только эти органы втягиваются, блуждающий нерв становится доступным. Втягивание желудка может нарушить дыхание, и в этом случае втягивающее устройство ослабляется. Кроме того, при разрезании соединительной ткани, окружающей пищевод, для доступа к блуждающему нерву следует соблюдать осторожность, чтобы избежать повреждения диафрагмы, которое может привести к нарушению внутригрудного давления, тяжелому угнетению дыхания и смерти животного во время операции. Рекомендуется, чтобы соединительная ткань, окружающая пищевод, была очищена ровно настолько, чтобы поместить электродную решетку над печеночной и чревной ветвями.
Возможные послеоперационные осложнения включают сращивание тканей вокруг пищевода, грыжу и послеоперационную кишечную непроходимость. Адгезия тканей может быть сведена к минимуму обильным нанесением стерильного физиологического раствора в брюшную полость во время операции и перед закрытием брюшной полости. Шов, закрывающий слой брюшины вместе с мышечным слоем, также должен помочь защитить внутренние органы и уменьшить адгезию тканей. Поскольку печень легко повреждается, а манипуляции с кишечником могут вызвать послеоперационную кишечную непроходимость, важно минимальное и бережное обращение с этими органами. Наконец, особенно у животных с большим весом, крайне важно, чтобы швы накладывались близко друг к другу или вместо них использовались прерывистые швы при закрытии брюшной полости, чтобы предотвратить выпячивание грыжи и ксифоидного отростка.
В качестве стандартного послеоперационного ухода животные должны регулярно проверяться после операции на наличие признаков дефекации, изменения веса, шерсти, уровня активности и наличия отека или выделений из операционных ран. В редких случаях могут возникать чрезмерные выделения, покраснение и отек вокруг операционных ран, что указывает на инфекцию. В таких случаях антибиотики, такие как Байтрил (0,2 мг/мл, в питьевой воде в течение 3-5 дней), назначаются до тех пор, пока инфекция не разрешится. В то время как нормальные крысы, как правило, хорошо восстанавливаются после операции, крысам с ослабленным состоянием здоровья (т.е. с моделями заболеваний) может потребоваться больше времени, прежде чем можно будет начать тестирование и стимуляцию после операции. Надлежащий послеоперационный уход (как описано в шаге 2.26) для таких животных имеет важное значение для благополучия животных.
Одно из ограничений этого протокола заключается в том, что, несмотря на то, что конструкция решетки VNS крысы отлично подходит для регистрации более медленного отклика С-волокна, расстояние между парами электродов (4,7 мм) может быть неподходящим для регистрации активности некоторых более быстрых типов волокон. Несмотря на то, что общая длина решетки ограничена доступной длиной субдиафрагмального блуждающего нерва над печеночной и чревной ветвями, эти матрицы VNS могут быть приобретены с дополнительными электродными парами. Такие массивы могут быть использованы для изучения применения блокирующей стимуляции, которая может манипулировать направлением VNS16,19, расширяя возможности использования этой модели.
Запись ECAP может быть использована для оценки размещения массива вокруг нерва, качества интерфейса электродов и способности устройства активировать волокна блуждающего нерва. Блуждающий нерв представляет собой вегетативный нерв, состоящий на 97%-99% из С-волокон18,20, а остальные 1%-3% волокон являются миелинизированными волокнами (функция неизвестна), что подтверждено исследованиями просвечивающей электронной микроскопии20. Ответы, показанные на рисунке 3, скорее всего, связаны с электрически вызванной активностью блуждающего нерва, а не с миогенной активностью, поскольку они соответствуют форме и форме сложного потенциала действия периферического нерва21,22. Кроме того, типичная скорость проводимости ECAP брюшного блуждающего нерва крысы составляет 0,47 - 1,2 м/с, что согласуется со скоростью проводимости С-волокон18. В первоначальных пилотных исследованиях по разработке устройства записи были подтверждены в исследованиях на крысах под наркозом путем перерезания блуждающего нерва между стимулирующим и регистрирующим электродом, что привело к устранению любых вызванных реакций (данные не показаны). Электродная решетка была спроектирована таким образом, что блуждающий нерв находится внутри платиново-силиконового канала, эффективно электрически изолируя его от окружающих структурных структур (например, пищевода). Стимуляция и запись также выполняются с использованием биполярных конфигураций с использованием смежных электродов, что еще больше сводит к минимуму возможности распространения стимуляции и загрязнения записи. Мы постоянно сообщали об аналогичных формах сигналов после электрической стимуляции блуждающего нерва брюшной полости в препаратах под наркозом и в состоянии бодрствования 10,15,16,19,23, включая исследования, в которых физиологические эффекты стимуляции подтверждали активацию блуждающего нерва 10,15,16. Несмотря на то, что невозможно исключить контаминацию записи миогенной активностью, миогенные реакции обычно отличаются от нейронных реакций благодаря их быстрому и большому профилю амплитуды роста24, в отличие от градуированных, меньших профилей роста, наблюдаемых в наших исследованиях10,15 и на рисунке 3A,B: День 0: текущая задержка 377 мкА: 7,24 мс > текущем уровне 1750 мкА: 6,74 мс.
В то время как активация субдиафрагмального блуждающего нерва, который почти полностью состоит из С-волокон20,25, показала свою эффективность для лечения доклинических моделей воспалительных заболеваний кишечника10, ревматоидного артрита15 и диабета16, оптимальные параметры ВНС брюшной полости для максимизации терапевтического эффекта не были полностью изучены14. Дальнейшие исследования по этой теме были бы очень полезны, так как применение ВНС брюшной полости для лечения воспалительных заболеваний кишечника в настоящее время исследуется в рамках первого клинического испытания на человеке. Поскольку противовоспалительный эффект ВНС брюшной полости считается системным26, существует большая вероятность того, что эта терапия также эффективна при других воспалительных состояниях, таких как системная красная волчанка27 и хроническая болезнь почек28.
Наши исследования на крысах показывают, что ВНС брюшной полости имеет уникальное преимущество перед ВНС шейного отдела позвоночника в том, что она не вызывает побочных эффектов для сердца или дыхания10. Стимуляция более высокой интенсивности может применяться в течение более длительных периодов времени без ущерба для дыхания или частоты сердечных сокращений животного. В сочетании с возможностью мониторинга вызванного нейронного ответа, подтверждающего интенсивность надпороговой стимуляции, этот метод представляет собой отличную модель для изучения эффективности ВНС брюшной полости для лечения различных заболеваний. По мере того, как применение ВНС продолжает расширяться, ожидается, что применение этого метода ВНС также будет расширяться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Данное исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Разработка имплантата VNS брюшной полости крысы финансировалась Агентством перспективных оборонных исследовательских проектов (DARPA) BTO под эгидой д-ра Дуга Вебера и д-ра Эрика Ван Гисона через Центр космических и военно-морских систем (контракт No N66001-15-2-4060). Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Инкубационным фондом Института бионики. Институт бионики выражает признательность за поддержку, которую они получают от правительства штата Виктория в рамках своей Программы поддержки операционной инфраструктуры. Мы хотели бы поблагодарить г-на Оуэна Бернса за механическое проектирование, профессора Джона Б. Фернесса за анатомическую экспертизу, профессора Роберта К. Шеперда за опыт в области периферийного интерфейса, нейромодуляции и записи, г-жу Филиппу Каммерер и г-жу Эми Морли за животноводство и тестирование, г-жу Фенеллу Мунц и д-ра Пету Григсби за их советы по послеоперационному уходу за животными, а также г-жу Дженни Чжоу и команду по изготовлению электродов из NeoBionica за производство матриц VNS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Briemarpak | SC3050 | |
| Baytril | Bayer | ||
| Betadine | Sanofi-Aventis Healthcare | ||
| Buprelieve (Buprenorphine) | Jurox | ||
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6210 | |
| DietGel Boost (dietary gel supplement) | ClearH2O | ||
| Dumont tweezer, style 5 | ProSciTech | T05-822 | |
| Dumont tweezer, style N7, self-closing | ProSciTech | EMS72864-D | |
| Elmasonic P sonicator | Elma | ||
| Hartmann's solution | Baxter | AHB2323 | |
| Hemostat | ProSciTech | TS1322-140 | |
| HPMC/PAA Moisturising Eye Gel | Alcon | ||
| Igor Pro-8 software | Wavemetrics, Inc | ||
| Isoflo (Isoflurane) | Zoetis | ||
| Isolated differential amplifier | World Precision Instruments | ISO-80 | |
| Liquid pyroneg | Diversey | HH12291 | cleaning solution |
| Marcaine (Bupivacaine) | Aspen | ||
| Plastic drape | Multigate | 22-203 | |
| Rat vagus nerve implant | Neo-Bionica | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis | ||
| Silk suture 3-0 | Ethicon | ||
| Silk suture 7-0 | Ethicon | ||
| SteriClave autoclave | Cominox | 24S | |
| Sterile disposable surgical gown | Zebravet | DSG-S | |
| Suicide Nickel hooks | Jarvis Walker | ||
| Ultrapure water | Merck Millipre | Milli-Q Direct | |
| Underpads | Zebravet | UP10SM | |
| Vannas scissors | ProSciTech | EMS72933-01 | |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon |
References
- Fang, Y. T., et al. Neuroimmunomodulation of vagus nerve stimulation and the therapeutic implications. Front Aging Neurosci. 15, 1173987 (2023).
- Fudim, M., et al. Device therapy in chronic heart failure: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 78 (9), 931-956 (2021).
- Sinniger, V., et al. A 12-month pilot study outcomes of vagus nerve stimulation in Crohn's disease. Neurogastroenterol Motil. 32 (10), 13911 (2020).
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation in patients with rheumatoid arthritis: 24 month safety and efficacy. Arthritis Rheumatol. 70, (2018).
- Genovese, M. C., et al. Safety and efficacy of neurostimulation with a miniaturised vagus nerve stimulation device in patients with multidrug-refractory rheumatoid arthritis: a two-stage multicentre, randomised pilot study. Lancet Rheumatol. 2 (9), e527-e538 (2020).
- Lu, J. Y., et al. A randomized trial on the effect of transcutaneous electrical nerve stimulator on glycemic control in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 13 (1), 2662 (2023).
- Huang, F., et al. Effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation on impaired glucose tolerance: a pilot randomized study. BMC Complement Altern Med. 14, 203 (2014).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- McAllen, R. M., Shafton, A. D., Bratton, B. O., Trevaks, D., Furness, J. B. Calibration of thresholds for functional engagement of vagal A, B and C fiber groups in vivo. Bioelectron Med (Lond). 1 (1), 21-27 (2018).
- Payne, S. C., et al. Anti-inflammatory effects of abdominal vagus nerve stimulation on experimental intestinal inflammation). Front Neurosci. 13, 418 (2019).
- Ben-Menachem, E., Revesz, D., Simon, B. J., Silberstein, S. Surgically implanted and non-invasive vagus nerve stimulation: a review of efficacy, safety and tolerability. Eur J Neurol. 22 (9), 1260-1268 (2015).
- Parhizgar, F., Nugent, K., Raj, R. Obstructive sleep apnea and respiratory complications associated with vagus nerve stimulators. J Clin Sleep Med. 7 (4), 401-407 (2011).
- Mao, H., Chen, Y., Ge, Q., Ye, L., Cheng, H. S. hort- and long-term response of vagus nerve stimulation therapy in drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Neuromodulation. 25 (3), 327-342 (2022).
- Payne, S. C., Furness, J. B., Stebbing, M. J. Bioelectric neuromodulation for gastrointestinal disorders: effectiveness and mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 89-105 (2019).
- Payne, S. C., Romas, E., Hyakumura, T., Muntz, F., Fallon, J. B. Abdominal vagus nerve stimulation alleviates collagen-induced arthritis in rats. Front Neurosci. 16, 1012133 (2022).
- Payne, S. C., et al. Blood glucose modulation and safety of efferent vagus nerve stimulation in a type 2 diabetic rat model. Physiol Rep. 10 (8), 15257 (2022).
- Shepherd, R. K., Fallon, J. B., Payne, S. C., Burns, O., Furness, J. B. Peripheral nerve electrode array. US patent. , US-2020230400-A1 (2019).
- Castoro, M. A., et al. Excitation properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Exp Neurol. 227 (1), 62-68 (2011).
- Payne, S. C., et al. Differential effects of vagus nerve stimulation strategies on glycemia and pancreatic secretions. Physiol Rep. 8 (11), 14479 (2020).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anat Embryol (Berl). 181 (2), 101-115 (1990).
- Gasser, H. S., Erlanger, J. The role played by the sizes of the constituent fibers of a nerve trunk in determining the form of its action potential wave. Am J Physiol-Legacy Content. 80 (3), 522-547 (1927).
- Parker, J. L., Shariati, N. H., Karantonis, D. M. Electrically evoked compound action potential recording in peripheral nerves. Bioelectron Med. 1 (1), 71-83 (2018).
- Villalobos, J., et al. Stimulation parameters for directional vagus nerve stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 16 (2023).
- Verma, N., et al. Characterization and applications of evoked responses during epidural electrical stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 5 (2023).
- Hoffman, H. H., Schnitzlein, H. N. The numbers of nerve fibers in the vagus nerve of man. Anat Rec. 139, 429-435 (1961).
- Bassi, G. S., et al. Anatomical and clinical implications of vagal modulation of the spleen. Neurosci Biobehav Rev. 112, 363-373 (2020).
- Courties, A., Berenbaum, F., Sellam, J. Vagus nerve stimulation in musculoskeletal diseases. Joint Bone Spine. 88 (3), 105149 (2021).
- Hilderman, M., Bruchfeld, A. The cholinergic anti-inflammatory pathway in chronic kidney disease-review and vagus nerve stimulation clinical pilot study. Nephrol Dial Transplant. 35 (11), 1840-1852 (2020).
