Summary
Dit protocol beschrijft de toepassing van antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) in een muizenmodel van orale candidiasis. aPDT werd uitgevoerd met behulp van een in water oplosbaar mengsel van curcuminoïden en blauw LED-licht.
Abstract
Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) is uitgebreid in vitro onderzocht en preklinische diermodellen van infecties zijn geschikt voor het evalueren van alternatieve behandelingen voorafgaand aan klinische onderzoeken. Deze studie beschrijft de werkzaamheid van aPDT in een muizenmodel van orale candidiasis. Veertig muizen werden immuunonderdrukt met subcutane injecties van prednisolon en hun tongen werden geïnoculeerd met behulp van een oraal wattenstaafje dat eerder was gedrenkt in een C. albicans-celsuspensie . Tetracycline werd in de loop van het experiment via drinkwater toegediend. Vijf dagen na schimmelinenting werden muizen willekeurig verdeeld in acht groepen; Een negende groep onbehandelde niet-geïnfecteerde muizen werd opgenomen als negatieve controle (n = 5). Drie concentraties (20 μM, 40 μM en 80 μM) van een mengsel van curcuminoïden werden getest met een blauw LED-licht (89,2 mW/cm2; ~455 nm) en zonder licht (respectievelijk C+L+ en C+L-groepen). Alleen licht (C-L+), geen behandeling (C-L-) en dieren zonder infectie werden als controles beoordeeld. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van Welch's ANOVA- en Games-Howell-tests (α = 0,05). Orale candidiasis werd vastgesteld bij alle geïnfecteerde dieren en macroscopisch gevisualiseerd door de aanwezigheid van karakteristieke witte vlekken of pseudomembranen op het dorsum van de tongen. Histopathologische secties bevestigden een grote aanwezigheid van gist en filamenten beperkt tot de verhoornde laag van het epitheel in de C-L-groep, en de aanwezigheid van schimmelcellen was visueel verminderd in de beelden verkregen van muizen die werden onderworpen aan aPDT met curcuminoïden van 40 μM of 80 μM. aPDT gemedieerd door 80 μM curcuminoïden bevorderde een vermindering van 2,47 log10 in het aantal kolonies in vergelijking met die in de C-L-groep (p = 0,008). Alle andere groepen vertoonden geen statistisch significante vermindering van het aantal kolonies, inclusief fotosensibiliserende (C+L-) of alleen licht (C-L+) groepen. Curcuminoïde-gemedieerde aPDT verminderde de schimmelbelasting van de tongen van muizen.
Introduction
Orale candidiasis (OC) is de belangrijkste schimmelinfectie van de mondholte; het wordt veroorzaakt door de overgroei van Candida spp. Predisponerende factoren voor OC zijn onder meer endocriene disfunctie, het gebruik van breedspectrumantibiotica, radio- en chemotherapie, voedingstekorten, xerostomie (lage speekselvloed), gebruik van kunstgebitten, slechte hygiëne en vooral immunosuppressie1. Van de Candida-soorten is Candida albicans de meest voorkomende en virulente; Het wordt aangetroffen als een commensale soort in het menselijk lichaam en als een opportunistische ziekteverwekker. C. albicans heeft het vermogen om zijn morfologie te veranderen van commensale gisten (blastopores) naar pathogene filamenten (hyfen en pseudohyfen)2. De filamenteuze vormen, vooral de hyfen, kunnen het epitheel van de gastheer binnendringen door endocytose of actieve penetratie, waardoor infectie ontstaat3. Andere virulentiefactoren van C. albicans zijn adhesie, biofilmvorming en secretie van lipolytische en hydrolytische enzymen en toxines, zoals lipasen, fosfolipasen, proteïnasen en candidalysine4.
OC-behandelingen omvatten het gebruik van antischimmelmiddelen, met name lokale polyenen en azolen (nystatine en miconazol)5. Ze vertonen echter alleen werkzaamheid op korte termijn en recidiveren komen vaak voor. Bovendien heeft het overmatig gebruik van antischimmelmiddelen geleid tot het probleem van de ontwikkeling en verspreiding van antischimmelresistentie6. Daarom zijn alternatieve therapieën nodig, zoals antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT), die een fotosensibilisator (PS) en licht combineert op een geschikte golflengte (dezelfde als die van de PS-absorptie) in aanwezigheid van zuurstof. PS's worden gebonden aan of opgenomen door cellen en produceren, wanneer ze door licht worden geactiveerd, reactieve zuurstofsoorten (ROS) die giftig zijn voor gesensibiliseerde cellen7.
Bij aPDT is een van de gebruikte fotosensibilisatoren (PS's) curcumine (CUR), een natuurlijk voorkomende verbinding die wordt gewonnen uit de wortelstokken van de kurkumaplant (Curcuma longa L.). Curcumine bezit tal van therapeutische eigenschappen, waaronder ontstekingsremmende, antioxiderende, kankerbestrijdende en antimicrobiële eigenschappen 8,9. Uit een eerder onderzoek bleek dat aPDT met behulp van CUR C. albicans effectief verminderde in een muizenmodel van orale candidiasis zonder schade toe te brengen aan de weefsels van de gastheer10. CUR is de belangrijkste curcuminoïde die wordt gewonnen uit kurkuma, maar andere polyfenolen, zoals demethoxycurcumine en bis-demethoxycurcumine, worden ook in deze plant aangetroffen. Curcuminoïde-gemedieerde aPDT toonde antibacteriële activiteit aan tegen biofilms van Staphylococcus aureus gekweekt in katheters11. Voor zover wij weten, blijft de schimmelwerende werking tegen C. albicans echter onduidelijk. Daarom evalueerden we in deze studie aPDT gemedieerd door een curcuminoïde zout tegen C. albicans in een muizenmodel van OC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoeksprotocol voor het gebruik van muizen is goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierlijk Gebruik (zaaknummers 05/2008 en 09/2020) van de School of Dentistry, Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) werd gebruikt als referentiestam. Zes weken oude vrouwelijke Zwitserse muizen (n = 45), met een lichaamsgewichtbereik van 20-30 g, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden geleverd door de São Paulo State University, UNESP, Botucatu.
1. Voorbereiding van PS en selectie van de lichtbron voor aPDT
- Bereid de PS voor volgens de specificaties voor de te testen stof.
OPMERKING: In deze studie werd een in water oplosbaar mengsel van curcuminoïden (op CUR gebaseerd wateroplosbaar zoutmengsel12) gebruikt als PS (zie Tabel met materialen en Figuur 1). Verdunningen bij 20 μM, 40 μM en 80 μM (respectievelijk 15,6, 29,2 en 58,4 mg/l) werden vlak voor gebruik bereid in ultrazuiver water en bij 5 °C bewaard. - Kies een lichtapparatuur met een geschikte golflengte (dezelfde als die van de PS-absorptie) die in staat is om het hele fotosensibiliserende doel gelijkmatig en gelijktijdig te verlichten zonder het weefsel te verwarmen.
OPMERKING: In deze studie werd een handstuk gebruikt met een lichtgevende diode (LED, zie Materiaaltabel), dat werd ontworpen aan het Instituto de Física de São Carlos (Universiteit van São Paulo, São Carlos, SP, Brazilië). Het uitgangsvermogen van het licht bedroeg 89,2 mW/cm2 bij een blauwe golflengte van ongeveer 455 nm.
2. Bereiding van het inoculum van C. albicans
- Bewaar de referentiestam C. albicans (ATCC 90028) in gist-pepton-glucose (YEPD, zie Materiaaltabel) met 50% glycerol bij -80 °C tot gebruik.
- Ontdooi de bevroren stam bij kamertemperatuur, verdeel een aliquot van 100 μl op een petrischaal met Sabouraud-dextrose-agar (SDA) met chlooramfenicol (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C.
- Breng vijf kolonies over in 10 ml giststikstofbouillon met 2% glucose (YNBg) medium en groei aëroob bij 37 °C gedurende 16 uur.
- Verdun de gistcultuur in vers YNBg (1:10) en incubeer aëroob bij 37 °C totdat de optische dichtheid de groeifase in het midden van de stam bereikt.
OPMERKING: Standaardiseer eerder de microbiële groeicurve voor elk laboratorium. In het huidige onderzoek mochten culturen ongeveer 8 uur incuberen, totdat ze de mid-log-fase van groei bereikten, zoals aangegeven door de optische dichtheid bij 540 nm (OD540), met een gemiddelde waarde van 0,536 ± 0,062 willekeurige eenheden (gemiddelde ± standaarddeviatie [SD]). - Centrifugeer de cultuur bij 5.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min, gooi het supernatans weg en was de pellet tweemaal met hetzelfde volume steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4).
- Gebruik aliquots van 100 μl voor het uitvoeren van vier seriële 10-voudige verdunningen in PBS, verdeel verdunningen op SDA-platen en incubeer bij 37 °C gedurende 48 uur voor het tellen van kolonies. Schimmelsuspensies worden standaard gebruikt in concentraties van ongeveer 4,5 × 107 kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/ml)].
3. Inductie van OC bij muizen
OPMERKING: De volgende methodologie is eerder beschreven door Takakura et al.13 en gereproduceerd door onze groep10,14, met enkele wijzigingen.
- Verdeel de muizen willekeurig in negen groepen (n = 5), wat overeenkomt met hetzelfde aantal behandelingen (aanvullend bestand 1).
OPMERKING: De mondholte van muizen moet negatief zijn voor de groei van Candida. Dit moet worden gecontroleerd door de mondholte uit te strijken en het monster op SDA te plaatsen. - Houd de dieren in propyleendozenvan 10 (max. 5 muizen per doos), met houtkrullen voor vloerbedekking, in een temperatuurgecontroleerd vivarium bij 23 ± 2 °C in een licht/donkercyclus van 12/12 uur. Er hoeft geen specifieke verrijking te worden verstrekt.
- Houd muizen ad libitum op een geëxtrudeerd muizendieet en gefilterd water.
- Subcutaan injecteren van het immunosuppressivum prednisolon (100 mg/kg lichaamsgewicht, zie materiaaltabel) voor de eerste keer op de eerste dag bij alle leden van de groepen C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ en C-L- (aanvullend dossier 1).
OPMERKING: Houd muizen uit dezelfde groep in dezelfde doos en controleer ze dagelijks op tekenen van stress en gewichtsverlies. Zoek veterinair advies voor pijnstillend of veranderd voedsel/water als stress of gewichtsverlies wordt opgemerkt. - Geef vanaf de eerste dag en tot het einde van het experiment tetracyclinehydrochloride in drinkwater in een dosis van 0,83 mg/ml13.
- Inoculeer muizentongen op dag twee, inclusief de groepen C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ en C-L- (aanvullend bestand 1), met het C. albicans-inoculum . Inoculeer die muizen uit de negatieve controlegroep (NCtrl) niet.
- Verdoof de dieren door intramusculaire injectie van 10 mg/kg chloorpromazinechloride (zie materiaaltabel) op elke dijspier voordat de inoculatie wordt uitgevoerd.
- Voer intraorale inoculatie van de muizen uit door een steriel wattenstaafje (één per dier) te weken in een vers bereide (d.w.z. direct voor inoculatie bereide) gestandaardiseerde suspensie van C. albicans.
- Plaats verdoofde muizen in rugligging. Trek hun tong voorzichtig uit hun mond met behulp van een steriele pincet. Wrijf de tong van elke muis gedurende 30 seconden in met een geweekt wattenstaafje. Houd muizen in de gaten totdat ze herstellen van de sedatie.
- Dien op dag vijf een aanvullende subcutane injectie met prednisolon (100 mg/kg lichaamsgewicht) toe om de immunosuppressie in stand te houden.
OPMERKING: Dit protocol is voldoende om de infectie 7 dagen na intraorale inoculatie te behouden. De tijdlijn van het protocol is weergegeven in figuur 2.
4. Antimicrobiële fotodynamische therapie en herstel van C. albicans uit orale laesies
- Verdoof de dieren op dag zeven, voorafgaand aan de behandeling, met behulp van een intraperitoneale injectie met ketaminehydrochloride (100 mg/kg lichaamsgewicht) in combinatie met xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) (zie materiaaltabel).
- Plaats elk dier in rugligging op een kussenapparaat14,15 dat is uitgerust met roestvrijstalen draden die om de snijtanden kunnen worden gelust om de bek open te houden.
OPMERKING: Isotherme pads worden aanbevolen om de muizen op te warmen terwijl ze verdoofd zijn, onderkoeling bij kamertemperatuur te voorkomen en sterfte in verband met anesthesie te voorkomen15. Elk verdoofd dier moet worden gecontroleerd door het ontbreken van een terugtrekkingsreflex wanneer de tenen worden bekneld om de anesthesiediepte te bevestigen. Indien nodig kan één onderhoudsdosis ketamine van 1/3 van de oorspronkelijke dosis (zonder xylazine) worden toegediend. - Met de onderkaak en wangen ingetrokken, plaatst u de tong voorzichtig buiten de mond.
- Voor muizen uit C+L+ groepen, pipetteer 70 μL van de PS op het dorsum van de tong (in een van de geteste concentraties). Houd de muizen in een donkere omgeving gedurende een periode van 20 minuten als pre-bestralingsperiode. Zorg ervoor dat gedurende deze tijd de tong van elk dier in de mondholte blijft om te voorkomen dat de fotosensibilisator (PS) wordt ingeslikt.
- Trek na de fotosensibilisatieperiode de tong uit de mond voor verlichting. Plaats het LED-apparaat op de rug van de tong en verlicht het bij 37.5 J/cm2 (7 min met het huidige apparaat) (Figuur 3).
- Voor dieren uit de C+L-groepen, pipetteer 70 μL van de PS in een van de geteste concentraties op het dorsum van de tong en houd deze muizen gedurende 27 minuten in het donker.
- Voor dieren uit de C-L+ groep (behandeld met licht zonder voorafgaande fotosensibilisatie), pipetteer 70 μL steriele zoutoplossing op het dorsum van de tong. Houd de muizen 20 minuten in het donker en verlicht vervolgens hun tong met 37,5 J/cm2 (7 minuten met het huidige apparaat).
- Voor muizen uit de C-L-groep (niet behandeld met PS of met licht), pipetteer 70 μL steriele zoutoplossing op het dorsum van de tong en houd ze 27 minuten in het donker.
- Herstel C. albicans uit de tongen van alle muizen onmiddellijk na de behandeling. Veeg het dorsum van de tong gedurende 1 minuut af met een steriel wattenstaafje.
- Plaats elk monsterwattenstaafje gedurende 1 minuut in een buisje met 1 ml steriele zoutoplossing en vortex om de microbiële cellen te resuspenderen.
- Voer onmiddellijk 10-voudige seriële verdunningen uit in PBS en plaat 25 μL aliquots over SDA-platen in tweevoud. Incubeer de platen aëroob bij 37 °C gedurende 48 uur.
- Gebruik na 48 uur een digitale kolonieteller (zie Materiaaltabel) om het aantal gistkolonies te bepalen. Bereken de belasting van C. albicans (CFU/ml) voor elk dier.
- Zet CFU/ml-waarden om in log10 en analyseer correct volgens het ontwerp van het experiment en de gegevensaannames.
OPMERKING: In het huidige onderzoek werd Welch's eenrichtings-ANOVA en Games-Howell post-hoctest (α = 0,05)16 gebruikt.
5. Histopathologische analyses
- Verdoof muizen op dag acht met ketamine van 100 mg/kg in combinatie met xylazine van 10 mg/kg via intraperitoniale injectie en euthanaseer ze met een overdosis ketamine (200 mg/kg toegediend via intraperiotonial). Bevestig de dood door te controleren op de afwezigheid van ademhalingsbeweging (apneu) en afwezigheid van hartslag (asystolie).
- Knijp voorzichtig in de tong en trek deze uit de bek van het dier. Maak met een handmatige scalpel een incisie vóór de circumvallate papillen om de hele tong operatief te verwijderen zonder verwondingen aan de voorste en centrale regio's te veroorzaken.
- Fixeer de tong gedurende 24 uur in 10% gebufferde formaline (pH 7,2-7,4) en was hem gedurende 2 uur onder stromend water.
- Ga verder met de opname in het paraffineproces: uitdroging, klaring en impregnering 10,14.
- Snijd seriële secties (5 μm dik) met behulp van een microtoom en plak de secties vervolgens op glasplaatjes. Ga verder met het kleuren van deze secties met behulp van periodiek zuur-Schiff en hematoxyline (PAS-H) voor histopathologisch onderzoek en het identificeren van schimmels door observatie onder een lichtmicroscoop.
- Vraag een patholoog, bij voorkeur blind voor de onderzochte groepen, om de weefselreactie als gevolg van C. albicans-infectie te onderzoeken.
- Beschrijf de histologische kenmerken van het weefsel (epitheel en bindweefsel), met name lokale ontstekingsreacties van verschillende intensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het muizenmodel van OC vertoonde typische witte vlekken en pseudomembranen op de tong van alle geïnfecteerde muizen (Figuur 4A). C. albicans teruggevonden uit C-L-dieren bevestigde weefselkolonisatie door dit micro-organisme (waarden varieerden van 1,62 x 104 tot 4,80 x 105 kve/ml). Zoals verwacht vertoonden dieren uit de NCtr-groep na bemonstering geen weefselveranderingen of koloniegroei (figuur 4B).
aPDT verminderde de levensvatbaarheid van C. albicans wanneer curcuminoïden werden gebruikt bij 80 μM voor fotosensibilisatie (Figuur 5). De gemiddelde log10-reductie die werd bereikt met 80 μM PS-gemedieerde aPDT was 2,47, vergeleken met die in de C-L-groep (p = 0,008).
Het aantal C. albicans-kolonies dat werd teruggevonden uit muizentongen was niet significant verschillend tussen muizen die werden behandeld met curcuminoïden zonder verlichting (C+L-groepen), muizen die met licht waren behandeld maar niet eerder fotosensibiliseerden (C-L+-groepen) en onbehandelde muizen (C-L-groep) (p ≥ 0,210).
De histologische kenmerken van de tongen van niet-geïnfecteerde dieren (NCtr) toonden normale/gezonde weefsels, waaronder intacte lamina propria, basaal membraan en filiforme papillen (Figuur 6A). Bij het onderzoeken van de histopathologische beelden van de tongen van de muizen uit de CL-groep was het daarentegen duidelijk dat gist en filamenten aanwezig waren in de verhoornde laag van het epitheel, hoewel er geen infiltratie van schimmels was. In het onderliggende bindweefsel werd een milde ontstekingsreactie waargenomen, voornamelijk gemedieerd door mononucleaire cellen, en filiforme papillen waren opvallend afwezig (Figuur 6B). De histologische analyse van de tongen van muizen in zowel de C+L- als de C-L+ groep vertoonde vergelijkbare kenmerken. Daarentegen onthulden de tongsecties van muizen die werden behandeld met 80 μM curcuminoïde-gemedieerde aPDT een verminderd aantal schimmelcellen, voornamelijk beperkt tot de verhoornde laag van het epitheel (Figuur 6C).
Figuur 1: Chemische structuur van de fotosensibilisator. De chemische structuur van het in water oplosbare zoutmengsel dat wordt gebruikt als fotosensibilisator, bestaande uit 53,4% natuurlijke curcumine en 46,6% andere curcuminoïden (demethoxycurcumine en bis-demethoxycurcumine). Het uiteindelijke gemiddelde molecuulgewicht is 730,32 g/mol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Protocoltijdlijn voor het muizenmodel van orale candidiasis en aPDT. Een tijdlijn met het protocol voor het muizenmodel van orale candidiasis en antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verlichting van muizentongen na fotosensibilisatie. Na fotosensibilisatie (incubatie van het geïnfecteerde weefsel met de fotosensibilisator) werden tongen verlicht met 37,5 J/cm2 met behulp van een blauw (~455 nm) LED-licht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Witte laesies in het muizenmodel voor orale candidiasis. (A) Representatieve afbeeldingen van de witte laesies die zijn waargenomen in het muizenmodel van orale candidiasis. (B) Negatieve (niet-geïnfecteerde) controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Candida albicans teruggevonden uit de tongen van muizen. De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde waarden ± standaarddeviatie van log10 (CFU/ml) van de behandelingsgroepen. Welch's eenrichtings-ANOVA gaf aan dat de effecten van de behandelingen statistisch significant verschilden tussen de groepen (p < 0,001). Verschillende kleine letters (a, b, c) naast de gemiddelden duiden op statistisch significante verschillen volgens de Games-Howell-test (p≤ 0,030). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve beelden van histologische doorsneden van muizentongen. Histologische secties van muizentongen werden gekleurd met PAS-H en de beelden werden vastgelegd met 200x. (A) Negatieve controlemuizen zonder geïnduceerde orale candidiasis, fotosensibilisatie en verlichting (NCtr-groep). (B) Muizen met geïnduceerde orale candidiasis, niet fotosensibiliseerd of blootgesteld aan LED-verlichting (CL-groep). (C) Dieren met geïnduceerde orale candidiasis, blootgesteld aan 80 μM curcuminoïden en 37,5 J/cm2 LED-verlichting (C+L+ 80-groep). Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Experimentele groepen. Een lijst van de experimentele groepen die in de huidige studie zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. albicans is in verband gebracht met orale en slokdarminfecties bij personen met een immuungecompromitteerde toestand, diabetes mellitus, langdurig gebruik van antibiotica en slechte mondhygiëne 1,3. De studie van menselijke infectieziekten vereist zowel in vitro als in vivo onderzoek voordat klinische proeven veilig en nauwkeurig kunnen worden opgezet. De huidige studie beschrijft een methode voor het opstellen van een muizenmodel van OC, dat kan worden gebruikt om de pathogenese van orale infecties door C. albicans en de werkzaamheid van antischimmelbenaderingen te evalueren 15,16,17,18,19.
Het hier gebruikte muizenmodel van OC werd met succes vastgesteld, zoals blijkt uit het substantiële herstel van de schimmelbelasting van laesies en uit de karakteristieke infectiekenmerken die werden waargenomen in de macroscopische en histopathologische analyses van de tongen van geïnfecteerde muizen. Veel studies hebben vergelijkbare muizenmodellen van OC gebruikt. In dergelijke modellen worden vrouwelijke muizen immuunonderdrukt en ingeënt met C. albicans, wat resulteert in laesies op de tong 10,13,14,15,20,21. Immunosuppressie met prednisolon, een glucocorticoïde, remt de activiteit van neutrofielen tegen C. albicans22. In deze studie werden vrouwelijke muizen immuunonderdrukt met twee subcutane injecties met prednisolon, één dag voor en drie dagen na infectie met C. albicans13. Bovendien veroorzaakte de toediening van tetracycline in drinkwater in de loop van het experiment orale dysbiose door orale bacteriën te verstoren en C. albicans te helpen gedijen23,24. Bovendien verhinderde de sedatie die werd veroorzaakt door de intramusculaire injectie van chloorpromazinechloride dat de dieren onmiddellijk na inoculatie water konden drinken en eten. Zo bleven schimmelcellen langer in contact met het dorsum van de tong, waardoor de ontwikkeling van kiembuizen en de overgang van gisten naar filamenten (hyfen en pseudohyfen) mogelijk werd, de pathogene morfologieën van C. albicans die het menselijk epitheel kunnen binnendringen. Teichert et al.25 gebruikten een immunodeficiëntieprotocol om OC bij muizen te induceren en vonden slechts 2 x 102 CFU/ml C. albicans.
Hoewel Totti et al.26 sialoadenectomische muizen gebruikten en vier afzonderlijke inentingen uitvoerden met een C. albicans-suspensie , is het opmerkelijk dat in hun geval de infectie bij de meeste dieren in de loop van het experiment niet werd opgelopen. In de huidige studie daarentegen werd de inoculatie met schimmelcellen slechts één keer uitgevoerd en resulteerde dit in het herstel van 104 CFU/ml C. albicans uit de mondholte. Deze studie maakte gebruik van het muizenmodel van candidiasis beschreven door Takakura et al.13, die orale inoculatie uitvoerden met een klinische stam geïsoleerd van een patiënt met cutane candidiasis (106 CFU/ml). Drie tot zeven dagen na inoculatie werden 105-10 6 CFU/ml C. albicans teruggevonden in de mondholte van muizen13. De verschillen tussen de methode van Takakura et al.13 en deze studie omvatten het gebruik van verschillende schimmelconcentraties in het inoculum (deze studie gebruikte 107 CFU/ml C. albicans) en verschillende C. albicans-stammen voor orale inoculatie (de referentiestam ATCC 90028 werd hier gebruikt). Carmello et al.20 gebruikten een soortgelijk protocol, waarbij dieren met immunosuppressie werden gebruikt. Ze dienden echter twee extra subcutane injecties met prednisolon toe aan de dieren op dag 1, 5, 9 en 13 van het experiment. Hun studie onthulde een positieve correlatie tussen de scores die werden toegekend aan de orale laesies van de geïnfecteerde dieren en het aantal CFU/ml over een periode variërend van 5 tot 16 dagen na infectie. In eerder onderzoek is algemeen bekend geworden dat het cruciaal is om dieren onder narcose nauwlettend in de gaten te houden om onderkoeling te voorkomen. Aanvullende onderhoudsdoses ketamine moeten discreet worden toegediend, alleen als dat nodig is27.
Wat de werkzaamheid van de toepassing van aPDT betreft, toonden de resultaten aan dat de bestraling van tongen die eerder waren behandeld met een 80 μM curcuminoïde zoutmengsel een significante vermindering (2,47 log10) van de levensvatbaarheid van C. albicans veroorzaakte. Histologische analyses toonden aan dat secties van tongen die werden behandeld met 80 μM curcuminoïde-gemedieerde aPDT een verminderd aantal schimmelcellen vertoonden, die beperkt waren tot de verhoornde laag, en een lage ontstekingsreactie. Het is de moeite waard om te benadrukken dat een ontstekingsreactie werd gedetecteerd bij alle muizen die besmet waren met C. albicans. Deze observatie impliceert dat de ontsteking die in alle aPDT-groepen wordt waargenomen, mogelijk verband houdt met Candida-infectie in plaats van te worden toegeschreven aan aPDT, een consistente bevinding in overeenstemming met onze eerdere onderzoeken 10,13,14,15.
Eerdere onderzoeken gebruikten CUR, methyleenblauw en fotodithazine (PDZ) als PS's en leverden veelbelovende resultaten op 10,20,24,25,27. In een vergelijkbare studie10 veroorzaakte een gecombineerde blootstelling aan CUR- en LED-licht een significante vermindering van de levensvatbaarheid van C. albicans; het gebruik van 80 μM CUR en licht verminderde echter de levensvatbaarheid van schimmels met 4,0 log10. Dovigo et al.10 gebruikten alleen CUR als PS, terwijl wij een zout gebruikten dat de drie belangrijkste curcuminoïden van C. longa bevatte. Toen CUR (260 μM) en LED-licht gedurende vijf opeenvolgende dagen werden gebruikt bij de behandeling van orale candidiasis bij muizen, constateerden de auteurs een vermindering van 1,11 log10 in de levensvatbaarheid van schimmels21. Toen methyleenblauw werd gebruikt als PS bij 450 μg/ml en 500 μg/ml, roeide aPDT C. albicans volledig uit de mondholte van muizen25. Bovendien, wanneer aPDT werd gemedieerd door PDZ (100 mg/L), werd een 3.0 log10 reductie en volledige remissie van orale laesies waargenomen20. Bovendien verhoogde aPDT de TNF-α expressie in vergelijking met die in de onbehandelde groep20. In een onderzoek waarbij een fluconazol-resistente stam werd gebruikt, bevorderde aPDT gemedieerd door PDZ (200 mg/L) een reductie gelijk aan 1,3 log1027. Bovendien resulteerde de combinatie van aPDT met nystatine in een substantiële vermindering van de levensvatbaarheid van schimmels, wat neerkomt op een afname van 2,6 log10, samen met opmerkelijke verbeteringen in orale laesies en een vermindering van de ontstekingsreactie27. Gezamenlijk leveren deze onderzoeken overtuigend bewijs voor de effectiviteit van aPDT bij het verminderen van schimmelbelasting binnen het muizenmodel van orale candidiasis, en onderstrepen ze het potentieel ervan als een klinische behandelingsoptie vanwege de antimicrobiële werkzaamheid zonder schade toe te brengen aan gastheerweefsels.
Concluderend is het muizenmodel van OC dat in deze studie wordt gebruikt, geschikt voor het nabootsen van infectie en het evalueren van de werkzaamheid van aPDT. Als beperking gebruikte het OC-model dat hier wordt gebruikt, slechts één referentiestam van C. albicans (andere stammen, klinische isolaten en niet-albicans Candida-soorten werden niet geëvalueerd). Bovendien kan de door corticosteroïden geïnduceerde immunosuppressie die bij muizen wordt gebruikt om een orale infectie te ontwikkelen, geen andere immunodeficiëntietoestanden nabootsen, zoals die als gevolg van HIV-infectie. Er kunnen ook verschillen zijn in de gastheercondities voor het ontwikkelen van OC, zoals de orale microbiota van muizen en mensen. Dit protocol moet verder worden uitgebreid om gemengde biofilms te evalueren die door meer dan één soort of door verschillende stammen van dezelfde soort worden gevormd. Bovendien zijn het voldoende verdoofd houden van muizen en het voorkomen van onderkoeling en het vermijden van anesthesiegerelateerde sterfte de moeilijkste stappen van het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken de financiële steun van FAPESP (São Paulo Research Foundation, procesnummer FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) en 2008/00601-6. We danken ook Dr. Ana Paula Silva voor het verstrekken van de informatie over het op water oplosbare zout op basis van CUR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E.
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G.
- Marôco, J. Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , ReportNumber 7th ed, Lisboa, Portugal. (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L. Jr, Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
