Här är ett protokoll för odling av placenta-explantat under konstanta flödesförhållanden. Detta tillvägagångssätt förbättrar traditionella statiska villösa odlingssystem genom att möjliggöra replikering av dynamiska fysiologiska miljöer.
De befintliga ex vivo-explanteringsodlingsmodellerna för placenta är i första hand baserade på statiska odlingssystem med hjälp av brunnsplattor. Dessa modeller återspeglar dock inte dynamiken i livmodern , där moderkakan utsätts för konstant lätt skjuvspänning på grund av plasma- eller blodflöde. För att ta itu med denna begränsning har ett flödesodlingssystem utformats för att föra ex vivo placenta-explantodling närmare de flödesförhållanden som upplevs i livmodern i moderns kropp. Inom detta tillvägagångssätt odlas placentaplantor i en sekvens av fem sammankopplade flödeskammare. Denna inställning upprätthåller fysiologiska syrekoncentrationer och en jämn flödeshastighet. Insamlade data visar att under flödesförhållanden uppvisar bevarandet av vävnadsmorfologi en anmärkningsvärd förbättring jämfört med konventionella statiska metoder. Denna innovativa teknik introducerar ett enkelt sätt att ex vivo placenta explantkultur, vilket ger en mer trogen representation av den dynamiska in vivo-miljön . Dessutom introducerar denna studie nya möjligheter att undersöka den funktionella dynamiken i gränssnittet mellan foster och mamma. Genom att anamma genomförbara dynamiska metoder underlättas en djupare förståelse av placentabiologi, vilket understryker dess relevans för moderns och fostrets hälsa.
Sedan 1960-talet har odling av placentaplantor på botten av en brunnsplatta använts för att studera gränssnittet mellan foster och moder 1,2,3. Denna metod är väletablerad och okomplicerad, vilket gör det möjligt att använda mänsklig vävnad för olika studier, förutom odlingar av enskilda celler 2,3. Med tiden har försöksdesignen för placentaexplantkulturer modifierats med avseende på syrekoncentration4 och för att förhindra att vävnaden sätter sig vid brunnsplattans botten 2,5,6. Denna metod har dock inte anpassats till in vivo-förhållandena i livmodern, särskilt närvaron av ett konstant flöde3.
Framgången för en graviditet beror på en adekvat och konsekvent perfusion av det intervillösa utrymmet med moderns blod, vilket etablerar en dynamisk krets med kontinuerligt inflöde och utflöde av blod och blodburna ämnen 7,8,9,10,11,12. Moderkakan har två distinkta blodtillförselsystem, ett för moderns blod och ett för fostrets blod, vilket resulterar i dubbel perfusion av både fostrets och moderns system13. Moderns blod börjar perfusionera moderkakans intervillösa utrymme i slutet av den första trimestern och strömmar långsamt genom vidgade spiralartärer i livmodern10,11,14. Följaktligen badar moderkakans villösa träd i moderns blod och levererar näringsämnen och syre till fostret. Detta moderns blod strömmar genom det intervillösa utrymmet innan det återvänder till moderns cirkulation via livmoderkakans vener. Under dess passage genom det intervillösa utrymmet leder diffusion och aktivt upptag av syre och näringsämnen i fostrets blod till lägre syre- och näringsnivåer i moderns blod12,15. Blodet i det intervillösa utrymmet ersätts dock helt av färskt, syrerikt blod ungefär två till tre gånger per minut, vilket säkerställer en kontinuerlig tillförsel av näringsämnen ochgaser. Noterbart är att syncytiotrofoblasten, den yttersta delen av placentabarriären, är den enda komponenten i placentaträdet som är direkt exponerat för moderns blod15,16,17. Följaktligen upplever syncytiotrofoblasten en konstant mild skjuvspänning från det strömmande maternella blodet 3,14.
Aktuell vetenskaplig kunskap om placentaflödesmiljön och moderna tekniska framsteg möjliggör nu en anpassad och fysiologiskt approximerad odling av placentaplantor under flödesförhållanden. Dessutom tyder bevis på att skjuvkrafter påverkar de biologiska funktionerna hos syncytiotrofoblasten 18,19,20,21. En välkänd metod som står för blodflödet är placenta-perfusionssystemet med dubbla lober22. Dessa experiment kräver dock betydande expertis, är tidsbegränsade (utförs endast i några timmar) och är endast genomförbara med moderkaksproverfrån tredje trimestern 3,23. Däremot har vi utvecklat en enkel och icke-påträngande teknik för ex vivo placenta villös explantkultur under konstanta flödesinställningar, som rymmer både första och tredje trimestern placentavävnader3. I denna uppställning odlas placentaplantor i fem seriekopplade flödeskammare. Villösa explantor fästs i kammarens botten med hjälp av nålformade upphöjningar på tunna metallplattor. Den konstruerade flödeskretsen överförs sedan till en bioreaktor, där både syrekoncentration och flödeshastighet regleras3. Flödesodlingsresultaten visar att vävnadsintegriteten bevaras bättre jämfört med den vanligtvis använda statiska metoden3. Dessutom möjliggör detta dynamiska tillvägagångssätt nya och anpassade experimentella designer för vävnadsexplantodling, vilket möjliggör in vitro-experiment som närmare efterliknar den naturliga miljön3.
Denna studie introducerar ett unikt perspektiv på en flödesodlingsteknik för placenta-explantat som är utformad för att replikera dynamiken i livmodermiljön 3,23. Resultaten visar att morfologin hos vävnad som odlats under flödesförhållanden bevaras bättre jämfört med den traditionella statiska odlingsmetoden3. Noterbart är att även om varken statiska eller flödesodlingsförhållanden underlättar perfusion av placentakärl, observerades förstörelsen av blodkärl från foster och placenta inuti det villösa stromat främst vid statisk odling, medan blodkärlens integritet verkade bibehållas bättre under en längre tid i flödesodling3.
En möjlig förklaring till denna observation kan kopplas till syncytiotrofoblastens avgörande skyddande och endokrina roll, en funktion som är väldokumenterad i litteraturen 12,24,25,26. Med tanke på detta är det tänkbart att den övergripande integriteten hos det yttre lagret av villi avsevärt bidrar till underhållet av det underliggande stromat, inklusive blodkärlen. Följaktligen kan blodkärlens bibehållna cellulära integritet under flödesförhållanden tillskrivas mediets kontinuerliga flöde. Denna rörelse hjälper till med explantens passiva rörelse, vilket underlättar utbytet av gaser, näringsämnen och nanopartiklar (som extracellulära vesiklar) över placentabarriären. Detta kan i sin tur ha en positiv inverkan på bevarandet av blodkärlens morfologi. Dessutom spelar fenomenet mekanosensation en roll i vävnadsmorfogenes i olika vävnader27,28. Studier har visat att mekanokänslighet påverkar cellulära processer på flera nivåer, vilket utlöser en rad biokemiska reaktioner som i slutändan påverkar vävnads- och organfunktionalitet29. Noterbart är att mekanokänsliga proteiner uttrycks av syncytiotrofoblasten under hela dräktigheten28. Vidare tyder studien på att mikrovilli på vävnadsytan kan vara inblandade i detta sammanhang28.
Ett ytterligare perspektiv som är värt att överväga är mitokondriernas potentiella roll i cellernas svar på flöde. Till exempel, i endotelceller, fungerar mitokondrier som signalomvandlare för cellulära svar på miljöstimuli30. Ökad ackumulering av lipiddroppar, observerad i statisk odlad vävnad genom TEM3, har associerats med apoptosinduktion på grund av mitokondriell dysfunktion31. Ytterligare undersökningar är nödvändiga för att avslöja de underliggande mekanismerna och nyckelfaktorerna, och koppla dem till signalvägar nedströms. Denna utforskning kan öka vår förståelse för hur vävnaden uppfattar och reagerar på skjuvspänning, vilket kan översättas till förbättrad livskraft och integritet hos villösa explantat i kultur23.
Flera kritiska protokollsteg måste upprepas och utföras med försiktighet. Efter moderkaksförlossningen ska vävnaden odlas så snabbt som möjligt. Under explantationsberedningen är det viktigt att undvika områden med synliga infarkter. Det är viktigt att försiktigt hantera explantat med en pincett för att förhindra att det kläms. Det rekommenderas att vävnaden är täckt med vätska under hela proceduren och att den utförs snabbt.
Det är viktigt att erkänna att denna studie inte kan specificera den exakta skjuvspänningen inom det presenterade flödessystemet, vilket bör betraktas som en begränsning i framtida undersökningar 3,23. Ändå är det viktigt att inse att exakt flödeshastighet och skjuvspänning för en specifik placentavilla in vivo påverkas av många parametrar, såsom de geometriska egenskaperna hos det intervillösa utrymmet, villusens placering inom detta utrymme och dess närhet och vinkel till moderns spiralartärer och livmodervener 3,19,23,32 . Komplexiteten i moderkakans geometriska struktur, som varierar mellan individer, måste också beaktas23,32. Matematiska modeller som uppskattar blodflödet inom det intervillösa utrymmet32 och beräkningar på väggskjuvspänning på syncytiotrofoblasten19,28 finns redan. Intressant nog förutspådde en studie att skjuvspänningen på syncytiotrofoblasten är lägre under den tredje trimestern jämfört med den första trimestern28, medan en annan studie visade rumsligt heterogen väggskjuvspänning på syncytiotrofoblasten19. Att bestämma den exakta flödeshastigheten och skjuvspänningen för en specifik placentavillus är fortfarande en utmaning 3,19,23,32. Sådana beräkningar ger en approximation av skjuvspänningsområdet för framtida undersökningar, men de kan kräva pågående anatomiska justeringar och optimering23. Dessutom kan framtida studier utveckla nya och förfinade genomströmningsodlingstekniker som tar hänsyn till den intrikata geometrin i det intervilösa utrymmet och strategier för att öka antalet prover per experiment3. Pågående framsteg och utveckling av flödessystemet förväntas, eventuellt med användning av alternativa flödeskammare (Brugger et al., opublicerade data, 2023).
Sammanfattningsvis lägger denna studie en robust grund genom att demonstrera en lätt implementerbar ex vivo-flödesodlingsteknik som upprätthåller den strukturella integriteten hos odlade villösa explantat. Det understryker betydelsen av dynamiska tekniker i studier av placentafunktionell biologi, vilket banar väg för ytterligare framsteg inom flödesodlingssystem och generering av nya idéer och hypoteser 3,23.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för det utmärkta tekniska stödet från Bettina Amtmann och Petra Winkler för vävnadsprovtagning. Denna forskning finansierades av Austrian Science Fund FWF (DOC 31-B26) och Medical University of Graz, Österrike, genom doktorandprogrammet Inflammatory Disorders in Pregnancy (DP-iDP).
6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
Metal plate with needles | In-house construction | ||
Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |