Ecco un protocollo per la coltura di espianti placentari in condizioni di flusso costante. Questo approccio migliora i tradizionali sistemi di coltura statica dei villi consentendo la replicazione di ambienti fisiologici dinamici.
I modelli di coltura di espianto placentare ex vivo esistenti sono principalmente basati su sistemi di coltura statici che utilizzano piastre a pozzetti. Tuttavia, questi modelli riflettono in modo inadeguato la dinamica in utero, in cui la placenta incontra un leggero stress di taglio costante dovuto al plasma o al flusso sanguigno. Per ovviare a questa limitazione, è stato ideato un sistema di coltura a flusso per avvicinare la coltivazione ex vivo dell’espianto placentare alle condizioni di flusso in utero sperimentate all’interno del corpo materno. Nell’ambito di questo approccio, gli espianti placentari vengono coltivati in una sequenza di cinque camere di flusso interconnesse. Questa impostazione mantiene le concentrazioni fisiologiche di ossigeno e una portata costante. I dati raccolti rivelano che, in condizioni di flusso, la conservazione della morfologia tissutale mostra un notevole miglioramento rispetto ai metodi statici convenzionali. Questa tecnica innovativa introduce un metodo semplice di coltura ex vivo dell’espianto placentare, offrendo una rappresentazione più fedele dell’ambiente dinamico in vivo . Inoltre, questo studio introduce nuove possibilità per studiare le dinamiche funzionali dell’interfaccia feto-materna. Abbracciando metodologie dinamiche fattibili, viene facilitata una comprensione più profonda della biologia placentare, sottolineandone l’importanza per la salute materno-fetale.
A partire dagli anni ’60, la coltivazione dell’espianto placentare sul fondo di una piastra a pozzetti è stata utilizzata per studiare l’interfaccia feto-materna 1,2,3. Questo metodo è ben consolidato e semplice, consentendo l’utilizzo di tessuto umano per vari studi, oltre a colture di singole cellule 2,3. Nel corso del tempo, i disegni sperimentali per le colture di espianto placentare sono stati modificati per quanto riguarda la concentrazione di ossigeno4 e per evitare che il tessuto si depositi sul fondo della piastra 2,5,6. Tuttavia, questo metodo non è stato adattato alle condizioni in vivo all’interno dell’utero, di particolare alla presenza di un flusso costante3.
Il successo di una gravidanza dipende da un’adeguata e costante perfusione dello spazio intervilloso con il sangue materno, stabilendo un circuito dinamico con continuo afflusso e deflusso di sangue e sostanze ematiche 7,8,9,10,11,12. La placenta presenta due distinti sistemi di afflusso di sangue, uno per il sangue materno e uno per il sangue fetale, con conseguente doppia perfusione da parte di entrambi i sistemi fetale e materno13. Il sangue materno inizia a perfondere lo spazio intervilloso della placenta alla fine del primo trimestre, scorrendo lentamente attraverso le arterie a spirale uterina allargate10,11,14. Di conseguenza, gli alberi villosi placentari vengono immersi nel sangue materno, fornendo sostanze nutritive e ossigeno al feto. Questo sangue materno scorre attraverso lo spazio intervilloso prima di tornare alla circolazione materna attraverso le vene uteroplacentare. Durante il suo passaggio attraverso lo spazio intervilloso, la diffusione e l’assorbimento attivo di ossigeno e sostanze nutritive nel sangue fetale portano a livelli più bassi di ossigeno e nutrienti nel sangue materno12,15. Tuttavia, il sangue dello spazio intervilloso è interamente sostituito da sangue fresco e ricco di ossigeno circa due o tre volte al minuto, garantendo un apporto continuo di nutrienti e gas13. In particolare, il sinciziotrofoblasto, la parte più esterna della barriera placentare, è l’unico componente dell’albero dei villi placentari direttamente esposto al sangue materno15,16,17. Di conseguenza, il sinciziotrofoblasto subisce un costante lieve sforzo di taglio da parte del sangue maternoche scorre 3,14.
Le attuali conoscenze scientifiche relative all’ambiente di flusso placentare e i moderni progressi tecnici consentono ora una coltivazione adattata e fisiologicamente approssimata di espianti placentari in condizioni di flusso. Inoltre, l’evidenza suggerisce che le forze di taglio influenzano le funzioni biologiche del sinciziotrofoblasto 18,19,20,21. Un approccio ben noto che tiene conto del flusso sanguigno è il sistema di perfusione placentare a doppio lobo22. Tuttavia, questi esperimenti richiedono una notevole esperienza, sono limitati nel tempo (condotti solo per poche ore) e sono fattibili solo con campioni placentari del terzo trimestre 3,23. Al contrario, abbiamo sviluppato una tecnica semplice e non intrusiva per la coltura ex vivo dei villi placentari in condizioni di flusso costante, adattandosi sia ai tessuti placentari del primo che del terzo trimestre3. In questa configurazione, gli espianti placentari vengono coltivati in cinque camere di flusso collegate in serie. Gli espianti villi sono fissati al fondo della camera mediante rilievi aghiformi su sottili piastre metalliche. Il circuito di flusso costruito viene successivamente trasferito in un bioreattore, dove vengono regolate sia la concentrazione di ossigeno che la portata3. I risultati della coltura a flusso dimostrano che l’integrità dei tessuti è meglio preservata rispetto al metodo statico3 tipicamente utilizzato. Inoltre, questo approccio dinamico consente disegni sperimentali nuovi e adattati per la coltura di espianto di tessuti, consentendo esperimenti in vitro che imitano più da vicino l’ambiente naturale3.
Questo studio introduce una prospettiva unica su una tecnica di coltura a flusso per espianti placentari progettata per replicare la dinamica dell’ambiente in utero 3,23. I risultati rivelano che la morfologia del tessuto coltivato in condizioni di flusso è meglio conservata rispetto al tradizionale metodo di coltivazione statica3. In particolare, anche se né le condizioni statiche né quelle di coltura a flusso facilitano la perfusione dei vasi placentari, la distruzione dei vasi sanguigni feto-placentari all’interno dello stroma villoso è stata osservata prevalentemente in coltura statica, mentre l’integrità dei vasi sanguigni sembrava essere meglio mantenuta per una durata più lunga nella coltura a flusso3.
Una possibile spiegazione di questa osservazione potrebbe essere legata al cruciale ruolo protettivo ed endocrino del sinciziotrofoblasto, una funzione ben documentata in letteratura 12,24,25,26. Alla luce di ciò, è ipotizzabile che l’integrità complessiva dello strato esterno dei villi contribuisca in modo significativo al mantenimento dello stroma sottostante, compresi i vasi sanguigni. Di conseguenza, l’integrità cellulare sostenuta dei vasi sanguigni in condizioni di flusso potrebbe essere attribuita al flusso continuo del mezzo. Questo movimento aiuta il movimento passivo degli espianti, facilitando lo scambio di gas, sostanze nutritive e nanoparticelle (come le vescicole extracellulari) attraverso la barriera placentare. Questo, a sua volta, potrebbe avere un impatto positivo sulla conservazione della morfologia dei vasi sanguigni. Inoltre, il fenomeno della meccanosensazione gioca un ruolo nella morfogenesi tissutale in vari tessuti27,28. Gli studi hanno dimostrato che la meccanosensibilità influenza i processi cellulari a più livelli, innescando una serie di risposte biochimiche che alla fine influenzano la funzionalità dei tessuti e degli organi29. In particolare, le proteine meccanosensibili sono espresse dal sinciziotrofoblasto durante la gestazione28. Inoltre, lo studio suggerisce che i microvilli sulla superficie del tessuto possono essere implicati in questo contesto28.
Un’ulteriore prospettiva che vale la pena considerare è il potenziale ruolo dei mitocondri nella risposta cellulare al flusso. Ad esempio, nelle cellule endoteliali, i mitocondri fungono da trasduttori di segnale per le risposte cellulari agli stimoli ambientali30. L’aumento dell’accumulo di goccioline lipidiche, osservato nel tessuto in coltura statica attraverso TEM3, è stato associato all’induzione dell’apoptosi a causa della disfunzione mitocondriale31. Sono necessarie ulteriori indagini per svelare i meccanismi sottostanti e i fattori chiave, collegandoli alle vie di segnalazione a valle. Questa esplorazione potrebbe migliorare la nostra comprensione di come il tessuto percepisce e reagisce allo stress di taglio, traducendosi in una migliore vitalità e integrità degli espianti di villi in coltura23.
Diversi passaggi critici del protocollo devono essere ripetuti ed eseguiti con cura. Dopo il parto placentare, il tessuto deve essere coltivato il più rapidamente possibile. Durante la preparazione dell’espianto, è fondamentale evitare le aree con infarti visibili. È importante maneggiare delicatamente gli espianti con una pinza per evitare la compressione. Si raccomanda di mantenere il tessuto coperto di liquido durante tutta la procedura e di condurla rapidamente.
È importante riconoscere che questo studio non è in grado di specificare l’esatta sollecitazione di taglio all’interno del sistema di flusso presentato, il che dovrebbe essere considerato come una limitazione nelle indagini future 3,23. Tuttavia, è importante riconoscere che la velocità precisa del flusso e lo sforzo di taglio per uno specifico villo placentare in vivo sono influenzati da numerosi parametri, come le caratteristiche geometriche dello spazio intervilloso, la posizione del villo all’interno di questo spazio e la sua vicinanza e angolo alle arterie a spirale materne e alle vene uterine 3,19,23,32 . Va presa in considerazione anche la complessità della struttura geometrica della placenta, che varia da individuoa individuo 23,32. Esistono già modelli matematici per la stima del flusso sanguigno all’interno dello spazio intervilloso32 e calcoli sullo sforzo di taglio della parete sul sinciziotrofoblasto 19,28. È interessante notare che uno studio ha previsto che lo sforzo di taglio sul sinciziotrofoblasto è inferiore nel terzo trimestre rispetto al primo trimestre28, mentre un altro ha dimostrato uno sforzo di taglio della parete spazialmente eterogeneo sul sinciziotrofoblasto19. Determinare la velocità precisa del flusso e lo sforzo di taglio per uno specifico villo placentare rimane una sfida 3,19,23,32. Tali calcoli offrono un’approssimazione dell’intervallo di sollecitazione di taglio per indagini future, ma possono richiedere continui aggiustamenti anatomici e ottimizzazioni23. Inoltre, studi futuri potrebbero sviluppare nuove e raffinate tecniche di coltura flow-through che tengano conto dell’intricata geometria dello spazio intervilloso e delle strategie per aumentare il numero di campioni per esperimento3. Si prevede che il progresso e lo sviluppo in corso del sistema di flusso utilizzino, potenzialmente impiegando camere di flusso alternative (Brugger et al., dati non pubblicati, 2023).
In conclusione, questo studio getta solide basi dimostrando una tecnica di coltura a flusso ex vivo facilmente implementabile che sostiene l’integrità strutturale degli espianti di villi coltivati. Sottolinea l’importanza delle tecniche dinamiche negli studi di biologia funzionale placentare, aprendo la strada a ulteriori progressi nei sistemi di coltura a flusso e alla generazione di nuove idee e ipotesi 3,23.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori apprezzano con gratitudine l’eccellente supporto tecnico di Bettina Amtmann e Petra Winkler per il campionamento dei tessuti. Questa ricerca è stata finanziata dall’Austrian Science Fund FWF (DOC 31-B26) e dall’Università di Medicina di Graz, Austria, attraverso il programma di dottorato Disturbi infiammatori in gravidanza (DP-iDP).
6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
Metal plate with needles | In-house construction | ||
Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |