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Bioengineering

Un guide pratique de l’évolution quasi continue assistée par phage et robotique

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65974
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1The Francis Crick Institute, 2Massachusetts Institute of Technology, 3Future House

Summary

L’évolution quasi continue assistée par phage et robotique (PRANCE) est une technique d’évolution rapide et robuste des protéines. La robotique permet la parallélisation des expériences, la surveillance en temps réel et le contrôle de la rétroaction.

Abstract

Les techniques d’évolution accélérée par la robotique améliorent la fiabilité et la vitesse de l’évolution en utilisant le contrôle par rétroaction, améliorant ainsi les résultats des expériences d’évolution des protéines et des organismes. Dans cet article, nous présentons un guide pour configurer le matériel et les logiciels nécessaires à la mise en œuvre de l’évolution quasi continue assistée par phage et robotique (PRANCE). PRANCE combine une évolution moléculaire rapide basée sur les phages avec la capacité d’exécuter simultanément des centaines d’expériences d’évolution indépendantes et contrôlées par rétroaction. Cet article décrit les exigences matérielles et la configuration de PRANCE, y compris un instrument de manipulation de liquides, un lecteur de plaques, des pompes auxiliaires, des réchauffeurs et des conteneurs imprimés en 3D. Nous décrivons comment configurer le robot de manipulation de liquides pour qu’il soit compatible avec les logiciels open source basés sur Python. Enfin, nous fournissons des suggestions pour les deux premières expériences qui peuvent être menées avec un système PRANCE nouvellement construit qui exerce ses capacités et valide que le système est prêt à effectuer une évolution multiplexée. Ce guide est destiné à servir de manuel pour naviguer dans la configuration considérable de l’équipement associée à la conduite d’une évolution accélérée par la robotique.

Introduction

PRANCE est une combinaison de deux puissantes techniques d’évolution dirigée. La première est PACE1, une technique moléculaire qui associe des cycles de diversification et de sélection de gènes au cycle de vie rapide du bactériophage M13, permettant à des cycles d’évolution rapides de se produire en continu dans la culture de phages liquides. Cette sélection est pilotée par l’utilisation d’un circuit génique codé par un plasmide qui couple la fonction de la protéine en évolution à l’expression de pIII, la protéine de la queue de M13, qui est nécessaire à la propagation des phages, comme l’illustre la figure 1. Au niveau expérimental, la dilution continue de la culture de phages liquides permet une sélection continue. La rigueur de sélection peut ainsi être modulée à la fois au niveau du circuit génique et au niveau expérimental en contrôlant le taux de dilution de la culture de phages. PACE peut donc être appliqué à tout défi d’ingénierie des biomolécules pour lequel il existe un capteur moléculaire capable de détecter l’activité souhaitée chez les bactéries E. coli pour induire l’expression de pIII. Les applications comprennent l’évolution de la liaison protéine-protéine 2,3,4, de la liaison protéine-ADN5, de la solubilité des protéines6 et de nombreuses fonctions enzymatiques spécifiques7. Le deuxième est l’évolution accélérée par la robotique 8,9, qui utilise un contrôleur de rétroaction pour éliminer deux modes de défaillance courants de l’évolution dirigée : l’extinction, qui se produit lorsque l’environnement est trop strict, et le manque d’évolution, qui se produit lorsque l’environnement est trop indulgent. Contrairement au passage en série de phages comme dans PANCE (Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10, l’évolution « quasi-continue » accélérée par la robotique implique un pipetage rapide qui maintient les cultures à mi-log, permettant aux populations de connaître des cycles continus d’infection et de propagation. Lorsque ces deux technologies sont utilisées ensemble, elles sont appelées PRANCE, pour Phage and Robotics-assisted Near-continuous Evolution8, qui permet une évolution continue robuste, multiplexée et rapide. PRANCE a été utilisé pour faire évoluer des polymérases, des ARNt et des ARNt amino-acyl synthétases et pour effectuer un contrôle de rétroaction au cours de ces évolutions afin d’améliorer leur vitesse et leur fiabilité8.

Il existe plusieurs détails de la configuration matérielle et logicielle de PRANCE qui permettent l’utilisation de bactériophages sur un robot de manipulation de liquides. Au lieu d’utiliser le logiciel par défaut fourni par le fabricant du robot, nous utilisons un progiciel open source basé sur Python11, qui permet une exécution rapide et simultanée et donc la possibilité de maintenir les bioréacteurs semi-continus à mi-log. Le temps libre des chercheurs peut être prolongé à plusieurs jours en faisant en sorte que plusieurs composants sur le pont s’autostérilisent régulièrement, et cela est réalisé grâce au contrôle automatique des pompes qui peuvent blanchir et rincer ces composants. La contamination croisée par les phages peut être éliminée par l’utilisation d’un robot de manipulation des liquides qui n’utilise pas d’embouts à ajustement forcé et un réglage minutieux des paramètres de manipulation des liquides.

Protocol

1. Configuration matérielle

REMARQUE : Voir la Figure 2 pour une vue d’ensemble des composants matériels d’un système PRANCE et la Figure 3 pour des photos de ces composants assemblés physiquement.

  1. Procurez-vous le matériel principal du système PRANCE, y compris un instrument de manipulation des liquides, un lecteur de plaques et des pompes auxiliaires.
    REMARQUE : Tous les systèmes PRANCE à ce jour ont été mis en œuvre sur des instruments de manipulation de liquides de taille moyenne à grande équipés d’un bras de pipetage à 8 canaux adressables individuellement, d’un bras de pipetage à 96 pointes à piston unique, d’un préhenseur robotisé pour le déplacement des plaques, d’une station de lavage intégrée pour la stérilisation des pointes et d’un lecteur de plaques intégré capable de mesurer l’absorbance et la luminescence.
  2. Configurez les stratégies de chauffage en fonction du modèle et des caractéristiques du robot de manipulation de liquides. Utilisez un porte-plaque chauffant ou un robot de climatisation par chauffage.
  3. Établissez une station de lavage des pointes pour permettre la réutilisation des pointes.
    REMARQUE : Jusqu’à présent, les systèmes PRANCE utilisaient des stations de lavage prêtes à l’emploi, bien qu’en principe, ce composant puisse facilement être construit à partir de composants peu coûteux.
  4. Établir une source de culture bactérienne maintenue en phase logarithmique en mettant en place un bioréacteur en temps réel fonctionnant à 37 °C comme chémostat/turbidostat. Alternativement, arrêter une culture bactérienne en phase logarithmique d’au moins 1 L de volume pré-cultivée à 37 °C en phase logarithmique (DO600 entre 0,25 et 0,45) à 4 °C dans un réfrigérateur à proximité. Assurez-vous que la culture, qu’elle soit réfrigérée ou tiède, est agitée régulièrement à l’aide d’une plaque agitée ou d’une plaque agitée pour éviter la sédimentation.
  5. Configurez les pompes préférées pour l’intégration robotique avec les logiciels et les pilotes nécessaires. Mettre en œuvre le logiciel pour permettre aux pompes de fournir des quantités définies de liquide de l’ordre de 10 à 100 ml.
    REMARQUE : reportez-vous à la table des matériaux pour les pompes utilisées dans cette implémentation et au site Web du fabricant pour connaître les logiciels utilisés pour faire fonctionner ces pompes et la documentation sur la façon de les configurer. Un tel logiciel pour les pompes utilisées dans la configuration de PRANCE illustrée dans ce manuscrit est fourni en open source dans le référentiel GitHub suivant https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE nécessite au moins un collecteur à trois pompes capable de pomper trois canaux distincts (livrer les bactéries au réservoir bactérien, délivrer de l’eau de Javel au réservoir bactérien et drainer le réservoir bactérien aux déchets), la vitesse de chacun étant calibrée et contrôlée indépendamment. Dans le passé, les gens ont utilisé des pompes d’aquarium et des réseaux de pompes hydroponiques, bien qu’en principe, n’importe quelle pompe péristaltique contrôlable par python puisse être utilisée. Les fonctions essentielles incluent la possibilité d’utiliser un préhenseur robotisé pour transférer des plaques dans ou hors du lecteur, pour lancer une mesure de lecteur de plaques et pour accéder aux mesures.
  6. Imprimez en 3D les composants de pont personnalisés requis pour le système PRANCE, y compris, au minimum, le réservoir/collecteur de distribution bactérien (« gaufre »), comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Fixez ces conteneurs sur le pont et calibrez leurs positions à l’aide du logiciel standard Liquid Handling Robot. Connectez le réservoir au réseau de pompes.
    REMARQUE : Consultez la documentation du fabricant du robot pour plus de détails sur la façon d’effectuer l’étalonnage car il dépendra du robot. Les imprimantes 3D à base de résine sont les plus appropriées ; un exemple du type d’imprimante utilisé est donné dans la table des matériaux ; La résine transparente standard a été utilisée avec les paramètres d’imprimante par défaut.
  7. Équiper le système d’un drain compatible avec les recommandations locales en matière de biosécurité.
  8. Placez le matériel de laboratoire sur le pont du robot de manipulation des liquides, comme illustré à la figure 4.
  9. Suivez les procédures de sécurité standard, y compris l’utilisation d’équipement de protection individuelle standard pour le laboratoire (c.-à-d. blouse de laboratoire, gants et protection oculaire).

2. Préparation du logiciel

  1. Installez un logiciel open source utilisé pour contrôler les robots de manipulation de liquides avec python11, disponible à partir du référentiel open source PyHamilton. https://github.com/dgretton/pyhamilton
  2. Modifiez et calibrez le fichier de disposition de la platine pour le logiciel du robot de manipulation des liquides afin de refléter avec précision les positions du matériel de laboratoire sur la platine du robot, comme illustré à la figure 4.
    REMARQUE : La configuration utilisée ici utilise le logiciel fourni par le fabricant du robot de manipulation de liquides, conformément à la documentation fournie.
  3. Exécutez le programme de méthode robotique PRANCE en mode simulation.
    1. Ouvrez la ligne de commande à l’aide des commandes suivantes (dans le système d’exploitation Windows), comme illustré à la figure 5.
      Touche Windows + R
      Entrez : cmd
    2. Remplacez le répertoire parent par le répertoire du programme de méthode robot. Entrez une commande comme ci-dessous avec le chemin d’accès correct, comme illustré à la figure 5.
      CD c :\Robot_methods_directory\PRANCE
    3. Appelez le programme de méthode robot avec Python avec l’indicateur de mode simulation, comme illustré à la figure 5.
      py robot_method.py --simuler
    4. Sélectionnez le bouton PLAY en haut à gauche de la fenêtre Contrôle d’exécution du robot qui s’ouvrira lors de l’exécution du programme (Figure 5).
      REMARQUE : Assurez-vous que la méthode PRANCE peut s’exécuter sans erreur dans la simulation avant de continuer. Il devient évident si le script est capable de fonctionner en mode simulation sans erreur, car il complétera plusieurs boucles du programme principal sans que la gestion des erreurs du système ne soit appelée, ce qui met fin à la boucle du programme principal.
  4. Exécutez le programme de méthode du robot PRANCE avec le mode simulation désactivé.
    1. Ouvrez la ligne de commande dans le répertoire approprié (Figure 5).
      Touche Windows + R
      Entrez : cmd
      CD c :\Robot_methods_directory\PRANCE
    2. Appelez le programme de méthode robot avec Python sans drapeaux :
      Py robot_method.py
    3. Sélectionnez le bouton PLAY en haut à gauche de la fenêtre Contrôle de l’exécution du robot qui s’ouvrira lorsque le programme sera exécuté.
    4. Vérifiez que PyHamilton peut contrôler l’instrument et provoquer son initialisation.
  5. Établissez une synchronisation des données en temps réel.
    REMARQUE : Jusqu’à présent, les systèmes PRANCE ont utilisé des ordinateurs en réseau qui permettent aux utilisateurs de surveiller les fichiers journaux et les graphiques de mesure des lecteurs de plaques en temps réel via un logiciel de partage de fichiers à distance ou via un bureau distant.
  6. Désactivez les mises à jour automatiques.

3. Préparation avant la course

  1. S’assurer que les sources de culture bactérienne en phase logarithmique sont disponibles pour toutes les cultures nécessaires à l’exploitation prévue et qu’elles sont activement agitées pour prévenir la sédimentation. Utilisez un chimiostat/turbidostat actif ou une culture précultivée réfrigérée arrêtée par la croissance.
  2. Mettre à jour le fichier manifeste du contrôleur avec les détails du volume (plage de 0 à 500 μL) de la culture bactérienne à pomper dans chaque puits de la lagune de 96 puits par cycle de programme. Cela permet un contrôle précis du taux de dilution effectif de la lagune. Cela peut être vu dans la figure 6.
    1. Calculer le taux de dilution de la lagune à l’aide de la feuille de calcul DilutionCalculator.xlsx (fournie dans le fichier supplémentaire 2), comme le montre la figure 7.
  3. Mettez à jour le fichier robot_method.py avec la hauteur de lagune prévue. Pour suivre ce protocole, utilisez 14 (en millimètres ) comme valeur par défaut pour la variable fixed_lagoon_height dans le programme. Cela correspond à un volume de lagune de 550 μL sur le système, mais peut différer selon la plaque de 96 puits de profondeur utilisée.
  4. Placez des pointes de pipette filtrées propres sur le plateau du robot dans leurs positions désignées et collez les porte-pointes sur les porte-pointes pour assurer la stabilité pendant le cycle.
  5. Placez des plaques propres à 96 puits profonds sur le pont du robot dans leurs positions désignées.
  6. Placez des plaques de lecture propres à 96 puits sur le pont du robot dans leurs positions désignées.
  7. Assurez-vous que le plateau de lecture de plaques n’est pas occupé par une plaque préexistante.
  8. Assurez-vous que les pompes sont connectées à l’ordinateur et qu’elles sont affectées à la bonne adresse.
  9. Nettoyez les conduites de pompe en activant les pompes pour pomper de l’eau de Javel, puis de l’eau.
  10. Connectez les conduites de pompe aux sources et sorties appropriées, en veillant à ce que les bonnes conduites soient connectées aux cultures bactériennes pertinentes.
  11. Remplissez les réservoirs/seaux contenant de l’eau de Javel et de l’eau pour le lavage des réservoirs bactériens et des pointes de pipette.
  12. S’assurer que tous les éléments sur le pont, en particulier les éléments mobiles, sont stabilisés dans leurs positions désignées.
  13. Activer les appareils de chauffage selon la mise en œuvre locale à la température cible (c’est-à-dire 37 °C ; Figure 8).
  14. Exécutez le fichier de protocole de stérilisation UV pendant 10 minutes pour faire fonctionner la lampe de stérilisation UV intégrée dans les robots de manipulation de liquides fournis par le fabricant (Figure 9).
    1. Sélectionnez le bouton PLAY en haut à gauche de la fenêtre Contrôle de l’exécution du robot qui s’ouvrira lorsque le programme sera exécuté.
    2. Exécutez le fichier avec l’option paramétrée pendant 600 s.
  15. Assurez-vous que le logiciel Robot Run Control est fermé.
    REMARQUE : Le programme de méthode du robot se bloquera s’il existe des instances existantes du logiciel Run Control en cours d’exécution.

4. Intégration matérielle et logicielle

  1. Effectuez un « passage à l’eau », où le programme de méthode robotique PRANCE est exécuté pendant la nuit avec de l’eau remplaçant toutes les cultures et les réactifs humides.
    REMARQUE : Ce test peut être effectué à température ambiante.
    1. Terminer la préparation préalable à l’exécution comme indiqué ci-dessus avec le controller_manifest et le robot_method configurés pour un taux de dilution efficace de la lagune de 1 volume/h, comme le montrent les figures 5 et 6.
    2. Connectez la conduite de « bactéries » à un récipient d’eau pour remplacer les bactéries en phase logarithmique pour le débit d’eau.
      REMARQUE : Du colorant alimentaire peut être ajouté aux sources d’eau pour suivre le mouvement du liquide tout au long de l’expérience.
    3. Ouvrez la ligne de commande dans le répertoire approprié.
    4. Appelez le programme de méthode robot avec Python avec le nouvel indicateur run (py robot_method.py --new) et entrez les arguments demandés, y compris le nom du fichier journal (TestRun), le nombre de puits de lagune (16), la durée du cycle (30), le nombre de cycles par mesure de plaque de lecteur (4) et le volume de l’inducteur (le volume de l’inducteur est 0μL pour ce test, lors d’une évolution où la mutagénèse est induite par l’arabinose, cette valeur peut être de 10 μL), comme le montre la figure 5.
    5. Sélectionnez le bouton PLAY en haut à gauche de la fenêtre Contrôle de l’exécution du robot qui s’ouvrira lorsque le programme sera exécuté une fois que les arguments auront été fournis.
      REMARQUE : La méthode PRANCE peut être démarrée à l’aide d’une plaque de lagune vide, et le volume liquide des lagunes s’équilibrera avec le volume final au cours des six premiers cycles.
  2. Effectuez un « run uniquement sur les bactéries », où le protocole PRANCE est exécuté pendant la nuit uniquement avec une culture bactérienne à la température cible mais sans bactériophage.
    1. Terminer la préparation préalable à l’exécution comme indiqué ci-dessus avec le controller_manifest et le robot_method configurés pour un taux de dilution efficace de 1 volume/h, comme le montrent les figures 5 et 6. Assurez-vous que les appareils de chauffage sont allumés à une température cible de 37 °C.
    2. Connectez la ligne « bactéries entrantes » à la source sélectionnée de bactéries en phase loglogarithmique.
    3. Ouvrez la ligne de commande dans le répertoire approprié.
    4. Appelez le programme de méthode robot avec Python avec le nouvel indicateur run (py robot_method.py --new) et entrez les arguments demandés, comme détaillé précédemment dans la section 4.1.4.
    5. Sélectionnez le bouton PLAY en haut à gauche de la fenêtre Contrôle de l’exécution du robot qui s’ouvrira lorsque le programme sera exécuté une fois les arguments fournis.
  3. Exécutez un « test d’infection », où les phages porteurs d’une protéine évoluée sont mis au défi de se propager sur des bactéries nécessitant cette protéine.
    REMARQUE : Décider à l’avance quelles lagunes seront inoculées avec des phages et quelles lagunes ne seront pas inoculées et serviront ainsi de lagunes sans phages pour détecter la contamination croisée.
    1. Terminer la préparation avant le passage comme indiqué ci-dessus avec le controller_manifest et le robot_method configurés pour un taux de dilution efficace de 1 volume/h, comme le montrent les figures 5 et 6. Assurez-vous que les appareils de chauffage sont allumés à une température cible de 37 °C.
    2. Connectez la ligne « bactéries entrantes » à la source sélectionnée de bactéries en phase loglogarithmique.
    3. Ouvrez la ligne de commande dans le répertoire approprié.
    4. Appelez le programme de méthode robot avec Python avec le nouvel indicateur run (py robot_method.py --new) et entrez les arguments demandés comme détaillé précédemment dans la section 4.1.4.
    5. Sélectionnez le bouton PLAY en haut à gauche de la fenêtre Contrôle de l’exécution du robot qui s’ouvrira lorsque le programme sera exécuté une fois que les arguments auront été fournis.
    6. Avant d’ajouter le bactériophage, exécutez la méthode pendant 2-3 h pour équilibrer le volume et la DO bactérienne dans les plaques de la lagune.
    7. Inoculer les lagunes avec phage avec 10à 6 UFP/mL de bactériophage à la fin d’un cycle d’exécution pendant que le programme est endormi (p. ex., 5,5 μL d’aliquote de phage à 108 UFP/mL, tel que déterminé par test sur plaque ou qPCR), dans une lagune de 550 μL.
    8. Exécutez le programme pendant la nuit, puis vérifiez le titre de phage dans les puits de la lagune par test de plaque ou qPCR.

Representative Results

Résultats des tests d’infection
Ce test révélera des problèmes liés à la culture bactérienne, au clonage de phages et au titre, à la stabilité de la température de l’équipement, aux paramètres de manipulation des liquides et à l’intégration du lecteur de plaques. Un test d’infection par les phages réussi révélera une infection par les phages claire et rapide dans les lagunes inoculées avec des phages, et aucun signal dans les lagunes sans phages. La figure 10 montre quelques résultats représentatifs d’un test d’infection par les phages. Les résultats expérimentaux peuvent également être comparés aux figures 1d et 1c de cet articlePRANCE 8, selon qu’une configuration « PRANCE chaud » (alimenté par un turbidostat bactérien vivant) ou « PRANCE froid » (alimenté par une culture réfrigérée en phase mi-logarithmique) est mis en œuvre. Ce test peut révéler plusieurs problèmes courants. Les problèmes de préparation des cultures bactériennes peuvent souvent entraîner une infection faible ou absente. Les bactéries ne peuvent être infectées de manière optimale par le phage M13 que lorsqu’elles sont en phase mi-log et à 37 °C. À d’autres températures et stades de croissance, ils présentent une expression plus faible du pilus et sont donc moins sensibles à l’infection par les phages12. L’inoculation d’un phage à faible titre ou d’un phage présentant des mutations de la colonne vertébrale peut entraîner un retard ou une absence de signal. Les problèmes de réglage du gain du lecteur de plaques pour la fluorescence ou la luminescence seront révélés par ce test.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du circuit génétique fonctionnant pendant le test d’infection de l’appareil PRANCE. Lorsque l’ARN polymérase T7, codée sur le génome du phage, infecte l’hôte Escherichia coli, elle est transcrite et se lie sur l’AP au niveau du promoteur T7, ce qui conduit à la transcription de la protéine phage pIII et de la protéine luxAB, qui, à son tour, facilite la propagation du phage et la production de luminescence. Abréviations : PRANCE = Évolution quasi continue assistée par phage et robotique ; AP = plasmide accessoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma des composants physiques du système PRANCE. Un réfrigérateur stocke les cultures remuées, qui sont ensuite déplacées sur le pont du robot par un ensemble de pompes, vers le réservoir bactérien, « la gaufre ». Le robot de manipulation des liquides est utilisé pour déplacer les cultures bactériennes de la « gaufre » à l’aide de la tête de pipetage vers les puits de rétention pour se réchauffer à la température d’incubation, puis vers les lagunes où se produit l’incubation principale. Les puits de rétention et les lagunes sont des plaques de puits profonds standard de 2 ml. Le robot prélève des échantillons dans des plaques de lecture à usage unique, qui sont à leur tour déplacées vers un lecteur de plaques pour la mesure. Abréviation : PRANCE = Évolution quasi continue assistée par phage et robotique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L’appareil robotique PRANCE. (A) Configuration PRANCE. (I) Filtre HEPA et chauffage externe. (II) Réfrigérateur de culture. (III) Enceinte principale du robot. (IV) Lecteur de plaques. (V) Pompes et réservoirs. (B) Enceinte du robot. (VI) Pompes de culture principales. (VII) Réservoirs d’eau, de déchets et d’eau de Javel. (VIII) Pompes de lave-glace. (C) Boîtier du robot. (IX) Bras de pipetage et pince robotisés. (X) Pointes de pipette. (XI) Composant imprimé en 3D pour permettre la distribution de la culture sur le robot (« la gaufre »). (XII) Plaques pour l’échantillonnage dans le lecteur de plaques. (XIII) Seaux pour le lavage des pointes. (XIV) « Lagunes » : récipients d’élevage où se déroule l’élevage évolutif. Abréviations : PRANCE = Évolution quasi continue assistée par phage et robotique ; HEPA = air particulaire à haute efficacité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Disposition du pont. (A) Représentation 3D de l’aménagement du pont dans le logiciel de contrôle du robot. (B) Photographie des composants du pont. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Capture d’écran de la ligne de commande avec des exemples de paramètres (ci-dessus) et exécuter le logiciel de contrôle (ci-dessous). Le bouton de lecture est situé en haut à gauche et peut être cliqué avec une souris ou actionné avec un écran tactile en fonction de la mise en œuvre locale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Fichier manifeste du contrôleur tel que configuré pour les séries de tests. Les lagunes contenant la culture #0 se trouveraient dans les colonnes 1 et 3 de la plaque de 96 puits profonds. Les colonnes restantes seraient vides. Les lignes A, B, D et E de la plaque à 96 puits profonds sont marquées sur la colonne de droite pour l’infection par phage (1), les autres lignes (0) sont des témoins sans phage. Ce cas de manifeste du contrôleur entraînerait la dilution de la lagune avec 210 μL de culture à chaque cycle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Calcul du taux de dilution effectif de la lagune à l’aide de la feuille de calcul DilutionCalculator. Voir le fichier supplémentaire 2 pour la feuille de calcul DilutionCalculator. Comme le montre cette figure, une lagune de 550 μL diluée par 210 μL de culture fraîche toutes les 30 minutes, avec 150 μL d’échantillons pour la mesure de la plaque de lecture tous les quatre cycles, correspondra à un taux de dilution effectif de 1,0 volume de lagune/h (après chaque 1 h, 50 % du liquide de la lagune d’origine au début de l’heure restera). figure.

Figure 8
Figure 8 : Système de chauffage robotisé. Le chauffage est activé en branchant l’alimentation électrique comme indiqué par le cercle rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Paramètres du protocole de décontamination UV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Mesure d’un test d’infection effectué sur le système PRANCE. Des échantillons sont prélevés pendant l’exploitation et des mesures de luminescence et d’absorbance sont effectuées. Pour chaque lagune, les mesures de luminescence sont divisées par la mesure d’absorbance correspondante et tracées en fonction du temps. Les lagunes qui ont été infectées par Phage sont colorées en vert, tandis que les lagunes témoins non infectées sont colorées en noir. Abréviation : PRANCE = Évolution quasi continue assistée par phage et robotique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Fichier STL pour l’impression 3D des composants de pont personnalisés requis pour le système PRANCE, y compris, au minimum, le réservoir/collecteur de distribution bactérien (« gaufre »). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Feuille de calcul DilutionCalculator. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Malgré les efforts de standardisation de l’équipement, en pratique, chaque configuration PRANCE sera différente en raison des changements dans l’approvisionnement en équipement, le matériel et la version des logiciels. Par conséquent, chaque configuration PRANCE présente des défis de configuration uniques, exigeant une compréhension complète de l’objectif de chaque composant pour un dépannage modulaire efficace.

Cette méthode définit un protocole étape par étape pour la configuration et la mise à l’essai d’un système PRANCE établi. Nous nous concentrons d’abord sur les éléments critiques du matériel et du logiciel, puis détaillons les étapes essentielles pour préparer et effectuer une série de tests, qui établissent que le système est prêt pour PRANCE.

Une caractéristique essentielle du matériel est l’optimisation pour réduire le risque de contamination croisée des échantillons lors d’expériences multiplexées utilisant des bactériophages. Il est recommandé d’utiliser exclusivement des pointes filtrées avec une technologie de pointe robotisée compatible avec la réutilisation des pointes et censée minimiser les aérosols produits lors de l’éjection des pointes en évitant les pointes à ajustement forcé. Un lavage robuste des pointes selon ce protocole permet la réutilisation des pointes, bien que l’adéquation de cette méthode doive être validée dans le cadre du test d’infection sur chaque système. L’autostérilisation dépend également d’un approvisionnement constant en eau et en eau de Javel pour le système. Ceux-ci sont stockés dans des réservoirs/seaux et, s’ils sont épuisés, ils entraîneront une autostérilisation altérée et une contamination croisée rapide. Des photographies peuvent être prises des réservoirs/seaux avant et après l’exécution du programme pour évaluer la vitesse à laquelle l’équipement de lavage consomme de l’eau et de l’eau de Javel en fonction d’une configuration de pompe particulière.

Un autre élément clé du système est le maintien de la phase de croissance bactérienne et de la température. Les expériences PRANCE sont menées à l’aide de la souche bactérienne S2060 E. coli (Addgene : #105064). Il s’agit d’une souche contenant le plasmide F dérivée de K12 optimisée pour réduire les biofilms7. De plus, le plasmide F de cette souche a été modifié avec l’ajout d’une cassette de résistance à la tétracycline pour l’entretien du plasmide, luxCDE et luxR pour compléter la surveillance de la luminescence médiée par luxAB, ainsi que lacZ sous le promoteur de choc phage pour permettre la visualisation colorimétrique des plaques. Le F-pilus codé par le plasmide F est nécessaire pour l’infection par les phages M13. Les bactéries utilisées dans PACE doivent donc être cultivées à 37 °C et en phase mi-log lorsque le F-pilus12 est exprimé et que l’infection, la propagation et l’évolution des phages M13 sont possibles. Pour la régulation statique de la température, un support de plaque chauffant standard peut être utilisé. Une alternative consiste simplement à chauffer l’air entrant dans le filtre HEPA à l’aide de radiateurs peu coûteux, bien que cela ne soit pas recommandé car cela peut entraîner une usure accélérée du matériel. De plus, cela accélère l’évaporation des fluides auxiliaires sur le pont, tels que les seaux d’eau de Javel et d’eau et l’inducteur, lorsqu’ils sont utilisés.

L’étalonnage des progiciels est également essentiel pour le bon fonctionnement du système. Les divergences entre la disposition du plateau logiciel et le plateau du robot sont la cause la plus fréquente de défaillance du système pendant le fonctionnement. L’étalonnage régulier des pompes auxiliaires qui alimentent la culture bactérienne, l’eau de Javel et la vidange du système est essentiel, car l’utilisation de la pompe péristaltique peut entraîner une usure des tubes et des modifications du volume de fluide.

Le test d’écoulement de l’eau révélera rapidement un certain nombre de problèmes de configuration courants, notamment des paramètres de manipulation des liquides incorrects, des fuites fluidiques/connexions défectueuses et une instabilité logicielle. Une course d’eau réussie ne présentera aucune fuite de liquide inattendue et fonctionnera de manière stable sans erreur pendant la nuit. Un certain nombre de problèmes courants peuvent survenir lors d’une coulée d’eau, tels que le non-respect de certaines étapes de manipulation des liquides, l’égouttement des pipettes et l’arrêt du protocole à mi-parcours. En cas de non-exécution de certaines étapes de manipulation des liquides, vérifiez que toutes les classes de liquides ont été installées. Ceux-ci répertorient la viscosité et les vitesses de pipetage appropriées et sont ajustés dans le logiciel de contrôle du robot fourni par le fabricant. En cas d’égouttement des pipettes, il est important que les réglages du bras de pipetage du robot soient corrects pour permettre un pipetage propre et éliminer la contamination croisée des phages. Un pipetage robotisé réussi nécessite, en plus des classes de liquide correctes, des hauteurs de pont correctes de tout le matériel de laboratoire et des décalages de hauteur de pipetage appropriés spécifiés dans le programme de méthode robotique PRANCE. Ces décalages de hauteur peuvent nécessiter un réglage direct. Si le protocole s’arrête en cours d’exécution, cela sera souvent généré par un large éventail d’erreurs qui indiquent que le fichier de disposition de la platine peut ne pas correspondre à la configuration réelle de la platine.

Le test de fonctionnement des bactéries uniquement révélera des problèmes avec les paramètres du lecteur de plaques et la visualisation des données en temps réel, des problèmes de concentration excessive d’eau de Javel ou de rinçage insuffisant, et la stabilité de la température. Une exploitation réussie avec des bactéries uniquement présentera un équilibre de l’absorbance de la lagune au cours des trois premiers cycles, suivie d’une absorption stable pendant toute la durée de l’exploitation. De plus, il peut révéler plusieurs problèmes courants. C’est la première étape où les données générées par le lecteur de plaques sont tracées. Les données de la base de données du lecteur de plaques peuvent ne pas être enregistrées ou tracées correctement. Si les bactéries ne parviennent pas à équilibrer leur absorbance, cela peut indiquer que la concentration d’eau de Javel est trop élevée. Un excès d’eau de Javel ou un lavage insuffisant peut stériliser toute l’expérience, plutôt que seulement le matériel de laboratoire. Si cela est suspecté, des bandelettes de détection d’eau de Javel peuvent être utilisées pour tester la lagune. La stabilité de la température de la culture peut être vérifiée avec un pistolet thermomètre.

Un test d’infection réussi indique que le système est prêt pour les exécutions PRANCE. Un test d’infection peut être effectué en inoculant un sous-ensemble de lagunes contenant une culture bactérienne. Ces bactéries expriment pIII lorsqu’elles sont infectées par le phage approprié qui n’a pas le gène de pIII (ΔgIII), permettant la propagation du phage. Une combinaison possible pour les tests consiste à utiliser des bactéries S2060 transformées avec un plasmide exprimant pIII sous le promoteur de choc des phages avec n’importe quel phage ΔgIII. Nous recommandons d’utiliser un phage ΔgIII portant l’ARN polymérase T7 de type sauvage avec des bactéries S2060 transformées avec un plasmide accessoire, dans lequel pIII et luxAB sont pilotés par le promoteur T7 (plasmide pJC173b13), comme illustré à la figure 1. Cela permet également de surveiller l’infection par le lecteur de plaques pendant le test. La preuve définitive du succès du test d’infection et de l’absence de contamination croisée proviendra du titrage des phages des lagunes de test et de contrôle. Lorsqu’un rapporteur luciférase est utilisé, une augmentation de la luminescence dans les puits d’essai uniquement, comme le montre la figure 3, est également un indicateur de réussite de l’infection et de la propagation des phages. L’étalon-or pour la quantification des titres de phages est le testde plaque 7. Il existe également un protocole de quantification de M13 par qPCR7 qui peut être plus rapide, bien que cela ne fasse pas de distinction entre les particules de phages infectieuses et non infectieuses et puisse donc surestimer les titres.

Le programme principal fait référence à un fichier manifeste, il s’agit d’un fichier de base de données en texte brut, qui dicte le volume de dilution par cycle de chaque culture en propagation ainsi que la sélection d’un nombre quelconque de matières premières potentielles de culture bactérienne, qui peuvent différer dans la rigueur de la sélection. De cette manière, le fichier manifeste définit de nombreux paramètres de l’exécution PRANCE. Il convient de noter que ce fichier peut être modifié pendant l’exécution par l’opérateur ou le système, ce qui signifie qu’un contrôle manuel ou automatique du retour d’information peut être effectué.

L’utilité d’une installation PRANCE pleinement fonctionnelle réside dans sa capacité à faire évoluer rapidement de grandes populations dans un environnement soigneusement surveillé et contrôlé. Le format à base de plaques distingue PRANCE des autres techniques, comme l’utilisation de systèmes plus petits à base de turbidostat14,15. La configuration à base de plaques facilite non seulement l’intégration avec des étapes de traitement robotisées supplémentaires, mais aussi la compatibilité avec d’autres instruments de laboratoire tels que les centrifugeuses. De plus, la possibilité de mener une évolution accélérée simultanément sur plusieurs instances introduit une dimension supplémentaire à l’expérience, améliorant les perspectives d’obtenir des résultats divers et robustes. Le système de contrôle granulaire et de rétroaction intégré à PRANCE renforce encore la prévisibilité et la fiabilité de l’expérience, marquant une avancée significative dans le domaine des techniques d’évolution dirigée. Cependant, cette technique est limitée dans le nombre d’expériences parallèles qu’elle peut mener. Selon la configuration, les configurations PRANCE sont généralement limitées soit par la vitesse de pipetage du robot, soit par l’espace disponible sur le pont.

Le même matériel et les mêmes logiciels utilisés pour PRANCE peuvent également être appliqués aux méthodes d’évolution qui n’impliquent pas de bactériophages. Comme démontré dans la méthode des nombreux turbidostats11, ce même instrument peut être utilisé exclusivement avec des bactéries, permettant des expériences d’évolution adaptative du génome entier. Cette adaptabilité élargit le champ d’application de cet instrument, ouvrant la voie à de nouvelles formes d’évolution accélérée par la robotique.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Emma Chory et Kevin Esvelt pour leur aide et leurs conseils en matière de configuration matérielle et logicielle. Samir Aoudjane, Osaid Ather et Erika DeBenedictis sont soutenus par la subvention de recherche précoce Steel Perlot. Ce travail a été soutenu par le Francis Crick Institute qui reçoit son financement de base de Cancer Research UK (CC2239), du UK Medical Research Council (CC2239) et du Wellcome Trust (CC2239).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printed bacterial reservoir "waffle" - - https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck
3D printer FormLabs Form 3B+ 3D printer components
3D printer resin (clear) FormLabs RS-F2-GPCL-04 consumable for 3D printer
8-1,000 µL head Hamilton 10140943 For Liquid handling robot
96-1,000 µL pipetting head Hamilton 10120001 For Liquid handling robot
Black polystyrene plate reader microplates Millipore Sigma CLS3603 For Robot deck
BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega BMG Labtech 10086700 For Liquid handling robot
Cleaning solution Fluorochem Limited F545154-1L used to clean the liquid handling parts of the robot
Deep Well plates Appleton Woods ACP006 these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot
encolsure heater Stego 13060.0-01 heats inside robot enclosure
Hamilton STAR Hamilton 870101 For Liquid handling robot
Heater Erbauer BGP2108-25 For Liquid handling robot
HIG Bionex centrifuge Hamilton 10086700 For Liquid handling robot
iSWAP plate gripper Hamilton 190220 For Liquid handling robot
laboratory tubing Merck Z280356 to construct liquid handling manifold
luer to barb connector AIEX B13193/B13246 for connectorizing tubing
Magnetic stir plate Camlab SKU - 1189930 For Auxiliary Fridge
Molcular pipetting arm Hamilton 173051 For Liquid handling robot
Omega BMG labtech 5.7 plate reader control software
One way Check Valves Masterflex MFLX30505-91 to one way sections of liquid handling manifold
pyhamilton MIT/Open source https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE open source python robot control software
pymodbus opensource 3.5.2 python pump software interface
Refrigetator Tefcold FSC175H allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat
S2060 Bacterial strain Addgene Addgene: #105064 E. coli
temperature controller Digiten DTC102UK Used to control heaters thermostatically
Thermostat switch controller WILLHI WH1436A WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot
Venus Hamilton 4.6 proprietary robot control software
Wash Station for MPH 96/384 Hamilton 190248 For Liquid handling robot
Suggested pump manufacturers
Company Catalog number Notes Documentation
Agrowtek AD6i Hexa Pump https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf
Amazon INTLLAB 12V DC
Cole-Parmer EW-07522-3 Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf
Cole-Parmer EW-07554-80 Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf

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References

  1. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
  2. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  3. Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
  4. Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
  5. Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
  6. Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
  7. Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
  8. DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
  9. Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
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  11. Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942 (2021).
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  13. Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
  14. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794 (2020).
  15. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).

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Aoudjane, S., Golas, S., Ather, O., Hammerling, M. J., DeBenedictis, E. A Practical Guide to Phage- and Robotics-Assisted Near-Continuous Evolution. J. Vis. Exp. (203), e65974, doi:10.3791/65974 (2024).

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