Summary
Phagen- und Robotik-unterstützte nahezu kontinuierliche Evolution (PRANCE) ist eine Technik für die schnelle, robuste Proteinevolution. Robotik ermöglicht die Parallelisierung von Experimenten, Echtzeitüberwachung und Feedback-Steuerung.
Abstract
Robotikbeschleunigte Evolutionstechniken verbessern die Zuverlässigkeit und Geschwindigkeit der Evolution durch Rückkopplungskontrolle und verbessern die Ergebnisse von Protein- und Organismus-Evolutionsexperimenten. In diesem Artikel stellen wir eine Anleitung zur Einrichtung der Hard- und Software vor, die für die Implementierung von Phagen- und Robotik-gestützter Near-continuous Evolution (PRANCE) erforderlich ist. PRANCE kombiniert eine schnelle Phagen-basierte molekulare Evolution mit der Möglichkeit, Hunderte von unabhängigen, rückkopplungsgesteuerten Evolutionsexperimenten gleichzeitig durchzuführen. In diesem Dokument werden die Hardwareanforderungen und das Setup für PRANCE beschrieben, einschließlich eines Liquid-Handling-Instruments, eines Plattenlesers, zusätzlicher Pumpen, Heizungen und 3D-gedruckter Behälter. Wir beschreiben, wie der Liquid-Handling-Roboter so konfiguriert wird, dass er mit Python-basierter Open-Source-Software kompatibel ist. Schließlich machen wir Vorschläge für die ersten beiden Experimente, die mit einem neu konstruierten PRANCE-System durchgeführt werden können, das seine Fähigkeiten ausübt und bestätigt, dass das System für die Multiplex-Evolution bereit ist. Dieser Leitfaden soll als Handbuch für die Navigation durch die beträchtliche Ausrüstungskonfiguration dienen, die mit der Durchführung einer roboterbeschleunigten Evolution verbunden ist.
Introduction
PRANCE ist eine Kombination aus zwei leistungsstarken gerichteten Evolutionstechniken. Die erste ist PACE1, eine molekulare Technik, die Runden der Gendiversifizierung und -selektion an den schnellen Lebenszyklus des M13-Bakteriophagen koppelt und so schnelle Evolutionsrunden in flüssigen Phagenkulturen ermöglicht. Diese Selektion wird durch die Verwendung eines Plasmid-kodierten Genschaltkreises angetrieben, der die Funktion des sich entwickelnden Proteins an die Expression von pIII, dem Schwanzhautprotein von M13, koppelt, das für die Phagenvermehrung benötigt wird, dies ist in Abbildung 1 dargestellt. Auf experimenteller Ebene ermöglicht die kontinuierliche Verdünnung der flüssigen Phagenkultur eine kontinuierliche Selektion. Die Selektionsstringenz kann somit sowohl auf der Ebene des Genkreislaufs als auch auf experimenteller Ebene moduliert werden, indem die Verdünnungsrate der Phagenkultur gesteuert wird. PACE kann daher auf jede Herausforderung im Bereich der Biomolekülentwicklung angewendet werden, für die es einen molekularen Sensor gibt, der die gewünschte Aktivität in E. coli-Bakterien nachweisen kann, um die pIII-Expression zu induzieren. Zu den Anwendungen gehören die Evolution der Protein-Protein-Bindung 2,3,4, der Protein-DNA-Bindung5, der Proteinlöslichkeit6 und zahlreicher spezifischer enzymatischer Funktionen7. Zweitens ist die roboterbeschleunigte Evolution 8,9, die einen Feedback-Controller verwendet, um zwei häufige Fehlermodi der gerichteten Evolution zu eliminieren: das Aussterben, das auftritt, wenn die Umwelt zu streng ist, und das Fehlen von Evolution, das auftritt, wenn das Umfeld zu nachsichtig ist. Im Gegensatz zur seriellen Passage von Phagen, wie sie in PANCE (Phagen-unterstützte nicht-kontinuierliche Evolution)7,10 durchgeführt wird, beinhaltet die roboterbeschleunigte "nahezu kontinuierliche" Evolution ein schnelles Pipettieren, bei dem die Kulturen in der Mitte der Log-Phase erhalten bleiben, so dass die Populationen kontinuierliche Infektions- und Vermehrungszyklen erleben können. Wenn diese beiden Technologien zusammen verwendet werden, werden sie als PRANCE (Phagen- und Robotik-unterstützte nahezu kontinuierliche Evolution8) bezeichnet, was eine robuste, gemultiplexte und schnelle kontinuierliche Evolution ermöglicht. PRANCE wurde verwendet, um Polymerasen, tRNAs und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen zu entwickeln und während dieser Entwicklungen eine Rückkopplungskontrolle durchzuführen, um ihre Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit zu verbessern8.
Es gibt mehrere Details des Hardware- und Software-Setups für PRANCE, die den Einsatz von Bakteriophagen auf einem Liquid-Handling-Roboter ermöglichen. Anstelle der vom Roboterhersteller bereitgestellten Standardsoftware verwenden wir ein Python-basiertes Open-Source-Softwarepaket11, das eine schnelle, gleichzeitige Ausführung und damit die Fähigkeit ermöglicht, die halbkontinuierlichen Bioreaktoren in der Mitte der Log-Phase zu halten. Die Hands-Off-Zeit der Forscher kann auf mehrere Tage verlängert werden, indem mehrere Komponenten an Deck routinemäßig selbst sterilisiert werden, und dies wird durch die automatische Steuerung von Pumpen erreicht, die diese Komponenten bleichen und spülen können. Phagenkreuzkontaminationen können durch den Einsatz eines Liquid-Handling-Roboters, der keine kraftschlüssigen Spitzen verwendet, und durch eine sorgfältige Anpassung der Liquid-Handling-Einstellungen vermieden werden.
Protocol
1. Hardware-Einrichtung
HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie eine Übersicht über die Hardwarekomponenten eines PRANCE-Systems und in Abbildung 3 Fotos dieser physisch montierten Komponenten.
- Besorgen Sie sich die primäre Hardware für das PRANCE-System, einschließlich eines Liquid-Handling-Geräts, eines Plattenlesers und zusätzlicher Pumpen.
HINWEIS: Alle bisherigen PRANCE-Systeme wurden auf mittleren bis großen Liquid-Handling-Instrumenten implementiert, die mit einem einzeln adressierbaren Pipettierarm mit 8 Kanälen, einem Einkolben-Pipettierarm mit 96 Spitzen, einem Robotergreifer zum Bewegen von Platten, einer integrierten Waschstation für die Spitzensterilisation und einem integrierten Plattenleser für Absorptions- und Lumineszenzmessungen ausgestattet sind. - Konfigurieren Sie die Heizstrategien je nach Modell und Ausstattung des Liquid-Handling-Roboters. Verwenden Sie einen beheizten Plattenträger oder eine heizungsvermittelte Roboterklimatisierung.
- Richten Sie eine Spitzenwaschstation ein, um die Wiederverwendung von Spitzen zu ermöglichen.
HINWEIS: Bisher wurden bei PRANCE-Systemen Waschstationen von der Stange verwendet, obwohl diese Komponente im Prinzip leicht aus kostengünstigen Komponenten hergestellt werden könnte. - Einrichtung einer Quelle für Bakterienkulturen, die in der Log-Phase gehalten werden, durch Einrichtung eines Echtzeit-Bioreaktors, der bei 37 °C als Chemostat/Turbidostat läuft. Alternativ kann eine bei 37 °C in logarithärer Phase (OD600 zwischen 0,25 und 0,45) bei 4 °C in einem nahe gelegenen Kühlschrank vorgezüchtete Bakterienkultur mit mindestens 1 l Volumen in einem nahe gelegenen Kühlschrank aufgefangen werden. Stellen Sie sicher, dass die Kultur, ob gekühlt oder warm, regelmäßig mit einer Schüttelplatte oder Rührplatte gerührt wird, um Sedimentation zu vermeiden.
- Konfigurieren Sie die bevorzugten Pumpen für die Roboterintegration mit der erforderlichen Software und Treiber. Implementieren Sie die Software, damit die Pumpen definierte Flüssigkeitsmengen in der Größenordnung von 10-100 ml fördern können.
HINWEIS: In der Materialtabelle für die in dieser Implementierung verwendeten Pumpen und auf der Website des Herstellers finden Sie die Software zum Betrieb dieser Pumpen und die Dokumentation zu deren Konfiguration. Eine solche Software für die Pumpen, die in dem in diesem Manuskript dargestellten PRANCE-Setup verwendet werden, wird im folgenden GitHub-Repository als Open Source zur Verfügung gestellt https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE mindestens einen Verteiler mit drei Pumpen benötigt, der in der Lage ist, drei separate Kanäle zu pumpen (Bakterien an das Bakterienreservoir liefern, Bleichmittel an das Bakterienreservoir abgeben und Bakterienreservoir in den Abfall entleeren), wobei die Geschwindigkeit jedes Kanals unabhängig kalibriert und gesteuert wird. In der Vergangenheit haben die Menschen Aquarienpumpen und Hydrokulturpumpenanordnungen verwendet, obwohl im Prinzip jede von Python steuerbare Schlauchpumpe verwendet werden kann. Zu den wesentlichen Funktionen gehört die Möglichkeit, mit einem Robotergreifer Platten in oder aus dem Lesegerät zu transferieren, eine Plattenlesermessung zu initiieren und auf Messungen zuzugreifen. - Drucken Sie die erforderlichen kundenspezifischen Deckkomponenten für das PRANCE-System in 3D, einschließlich mindestens des Bakterienreservoirs/des Verteilers ("Waffel"), wie in der Zusatzdatei 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Befestigen Sie diese Behälter auf dem Deck und kalibrieren Sie ihre Positionen mit der Standardsoftware von Liquid Handling Robot. Schließen Sie den Behälter an das Pumpenarray an.
HINWEIS: In der Dokumentation des Roboterherstellers finden Sie Einzelheiten zur Durchführung der Kalibrierung, da diese roboterabhängig ist. 3D-Drucker auf Harzbasis sind am besten geeignet; Ein Beispiel für den verwendeten Druckertyp ist in der Materialtabelle angegeben. Standard-Klarharz wurde mit den Standarddruckereinstellungen verwendet. - Statten Sie das System mit einem Abfluss aus, der mit den lokalen Biosicherheitsempfehlungen kompatibel ist.
- Legen Sie Laborgeräte auf das Deck des Liquid-Handling-Roboters, wie in Abbildung 4 dargestellt.
- Befolgen Sie die Standardsicherheitsverfahren, einschließlich der Verwendung von persönlicher Standardschutzausrüstung für Labore (z. B. Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz).
2. Software-Vorbereitung
- Installieren Sie Open-Source-Software zur Steuerung von Liquid-Handling-Robotern mit Python11, die im Open-Source-Repository PyHamilton verfügbar ist. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- Ändern und kalibrieren Sie die Deck-Layout-Datei für die Liquid Handling-Robotersoftware, um die Positionen der Laborgeräte auf dem Roboterdeck genau widerzuspiegeln, wie in Abbildung 4 gezeigt.
HINWEIS: Das hier verwendete Setup verwendet die vom Hersteller des Liquid-Handling-Roboters bereitgestellte Software gemäß der mitgelieferten Dokumentation. - Führen Sie das Robotermethodenprogramm PRANCE im Simulationsmodus aus.
- Öffnen Sie die Befehlszeile mit den folgenden Befehlen (im Windows-Betriebssystem), wie in Abbildung 5 dargestellt.
Windows-Taste + R
Geben Sie ein: cmd - Ändern Sie das übergeordnete Verzeichnis in das Verzeichnis des Robotermethodenprogramms. Geben Sie einen Befehl wie folgt mit dem richtigen Pfad ein, wie in Abbildung 5 dargestellt.
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Rufen Sie das Robotermethodenprogramm mit Python mit dem Simulationsmodus-Flag auf, wie in Abbildung 5 dargestellt.
py robot_method.py --simulate - Wählen Sie die Schaltfläche PLAY oben links im Fenster Robot Run Control , die sich öffnet, wenn das Programm ausgeführt wird (Abbildung 5).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PRANCE-Methode ohne Fehler in der Simulation ausgeführt werden kann, bevor Sie fortfahren. Es wird offensichtlich, ob das Skript in der Lage ist, im Simulationsmodus fehlerfrei zu arbeiten, da es mehrere Schleifen des Hauptprogramms abschließt, ohne dass die Fehlerbehandlung des Systems aufgerufen wird, wodurch die Hauptprogrammschleife beendet wird.
- Öffnen Sie die Befehlszeile mit den folgenden Befehlen (im Windows-Betriebssystem), wie in Abbildung 5 dargestellt.
- Führen Sie das Robotermethodenprogramm PRANCE mit deaktiviertem Simulationsmodus aus.
- Öffnen Sie die Befehlszeile im entsprechenden Verzeichnis (Abbildung 5).
Windows-Taste + R
Geben Sie ein: cmd
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Rufen Sie das Robotermethodenprogramm mit Python ohne Flags auf:
py robot_method.py - Wählen Sie die Schaltfläche PLAY oben links im Fenster Robot Run Control , die sich öffnet, wenn das Programm ausgeführt wird.
- Vergewissern Sie sich, dass PyHamilton das Gerät steuern und initialisieren kann.
- Öffnen Sie die Befehlszeile im entsprechenden Verzeichnis (Abbildung 5).
- Richten Sie eine Echtzeit-Datensynchronisierung ein.
HINWEIS: Bisher haben PRANCE-Systeme Netzwerkcomputer verwendet, die es Benutzern ermöglichen, die Protokolldateien und Echtzeit-Messdiagramme des Plattenlesers über eine Remote-Filesharing-Software oder über einen Remote-Desktop zu überwachen. - Deaktivieren Sie automatische Updates.
3. Vorbereitung vor dem Lauf
- Stellen Sie sicher, dass für alle für den geplanten Lauf erforderlichen Kulturen Bakterienkulturquellen in der Log-Phase verfügbar sind und dass sie aktiv gerührt werden, um eine Sedimentation zu verhindern. Verwenden Sie einen aktiven Chemostaten/Turbidostat oder eine wachstumshemmende, gekühlte vorgewachsene Kultur.
- Aktualisieren Sie die Controller-Manifestdatei mit den Details, welches Volumen (Bereich 0-500 μl) welcher Bakterienkultur pro Programmzyklus in jede Vertiefung der 96-Well-Lagune gepumpt werden soll. Dies ermöglicht eine präzise Steuerung der effektiven Verdünnungsrate der Lagune. Dies ist in Abbildung 6 zu sehen.
- Berechnen Sie die Verdünnungsrate der Lagune mithilfe der DilutionCalculator.xlsx Tabelle (als ergänzende Datei 2 bereitgestellt), wie in Abbildung 7 zu sehen.
- Aktualisieren Sie die robot_method.py Datei mit der beabsichtigten Lagunenhöhe. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie 14 (in Millimetereinheiten ) als Standardwert für die Variable fixed_lagoon_height im Programm. Dies entspricht einem Lagunenvolumen von 550 μl auf dem System, kann jedoch je nach verwendeter 96-Deep-Well-Platte unterschiedlich sein.
- Legen Sie saubere, gefilterte Pipettenspitzen an den dafür vorgesehenen Positionen auf das Roboterdeck und kleben Sie die Spitzengestelle an die Spitzenhalter, um die Stabilität während des Laufs zu gewährleisten.
- Legen Sie saubere 96-Deep-Well-Platten an den dafür vorgesehenen Positionen auf das Roboterdeck.
- Legen Sie saubere 96-Well-Leseplatten an den dafür vorgesehenen Positionen auf das Roboterdeck.
- Stellen Sie sicher, dass das Plattenlesefach nicht von einer bereits vorhandenen Platte belegt ist.
- Stellen Sie sicher, dass die Pumpen an den Computer angeschlossen und der richtigen Adresse zugewiesen sind.
- Reinigen Sie die Pumpenleitungen, indem Sie die Pumpen aktivieren, um Bleichmittel und dann Wasser zu pumpen.
- Schließen Sie die Pumpenleitungen an die entsprechenden Quellen und Ausgänge an und achten Sie genau darauf, dass die richtigen Leitungen mit den entsprechenden Bakterienkulturen verbunden sind.
- Füllen Sie Tanks/Eimer mit Bleichmittel/Wasser zum Waschen von Bakterienreservoirs und Pipettenspitzen nach.
- Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten an Deck, insbesondere mobile Elemente, in ihren vorgesehenen Positionen stabilisiert sind.
- Aktivieren Sie die Heizungen gemäß der lokalen Implementierung auf die Zieltemperatur (d. h. 37 °C; Abbildung 8).
- Führen Sie die UV-Sterilisationsprotokolldatei 10 Minuten lang aus, um die eingebaute UV-Sterilisationslampe in den vom Hersteller gelieferten Liquid-Handling-Robotern zu betreiben (Abbildung 9).
- Wählen Sie die Schaltfläche PLAY oben links im Fenster Robot Run Control , die sich öffnet, wenn das Programm ausgeführt wird.
- Führen Sie die Datei mit der parametrisierten Option 600 s lang aus.
- Stellen Sie sicher, dass die Robot Run Control-Software geschlossen ist.
HINWEIS: Das Robotermethodenprogramm stürzt ab, wenn Instanzen der Run Control-Software ausgeführt werden.
4. Hardware- und Software-Integration
- Führen Sie einen "Wasserlauf" durch, bei dem das PRANCE-Robotermethodenprogramm über Nacht ausgeführt wird, wobei Wasser alle Kulturen und Nassreagenzien ersetzt.
HINWEIS: Dieser Test kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden.- Schließen Sie die Vorbereitung vor dem Lauf wie oben beschrieben ab, wobei die controller_manifest und robot_method für eine effektive Lagunenverdünnungsrate von 1 Volumen/h eingerichtet sind, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6 dargestellt.
- Schließen Sie die "Bakterien in"-Leitung an einen Wasserbehälter an, um die Log-Phase-Bakterien für den Wasserlauf zu ersetzen.
HINWEIS: Den Wasserquellen kann Lebensmittelfarbe zugesetzt werden, um die Flüssigkeitsbewegung während des Experiments zu verfolgen. - Öffnen Sie die Befehlszeile im entsprechenden Verzeichnis.
- Rufen Sie das Robotermethodenprogramm mit Python mit dem neuen Run-Flag (py robot_method.py --new) auf und geben Sie die angeforderten Argumente ein, einschließlich des Protokolldateinamens (TestRun), der Anzahl der Lagunenbrunnen (16), der Zyklusdauer (30), der Anzahl der Zyklen pro Leseplattenmessung (4) und des Induktorvolumens (Induktorvolumen ist 0 μL für diesen Testlauf, während einer Evolution, bei der Mutagenese mit Arabinose induziert wird, kann dieser Wert 10 μl betragen), wie in Abbildung 5 dargestellt.
- Wählen Sie die Schaltfläche PLAY oben links im Fenster Robot Run Control , die sich öffnet, wenn das Programm ausgeführt wird, sobald Argumente angegeben wurden.
HINWEIS: Die PRANCE-Methode kann mit einer leeren Lagunenplatte gestartet werden, und das Flüssigkeitsvolumen der Lagunen gleicht sich in den ersten sechs Zyklen auf das endgültige Volumen aus.
- Führen Sie einen "Nur-Bakterien-Lauf" durch, bei dem das PRANCE-Protokoll nur über Nacht mit Bakterienkultur bei Zieltemperatur, aber ohne Bakteriophagen ausgeführt wird.
- Schließen Sie die Vorbereitung vor dem Lauf wie oben beschrieben mit dem controller_manifest ab und robot_method für eine effektive Lagunenverdünnungsrate von 1 Volumen/h eingerichtet, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6 dargestellt. Stellen Sie sicher, dass die Heizungen für eine Zieltemperatur von 37 °C eingeschaltet sind.
- Verbinden Sie die "Bakterien in"-Leitung mit der ausgewählten Quelle von Log-Phase-Bakterien.
- Öffnen Sie die Befehlszeile im entsprechenden Verzeichnis.
- Rufen Sie das Robotermethodenprogramm mit Python mit dem neuen Ausführungsflag (py robot_method.py --new) auf und geben Sie die angeforderten Argumente ein, wie zuvor in Abschnitt 4.1.4 beschrieben.
- Wählen Sie die Schaltfläche PLAY oben links im Fenster Robot Run Control , die geöffnet wird, wenn das Programm ausgeführt wird, sobald die Argumente angegeben wurden.
- Führen Sie einen "Infektionstest" durch, bei dem Phagen mit einem entwickelten Protein herausgefordert werden, sich auf Bakterien zu vermehren, die dieses Protein benötigen.
HINWEIS: Entscheiden Sie im Voraus, welche Lagunen mit Phagen geimpft werden und welche nicht geimpft werden und somit als Lagunen ohne Phagenbekämpfung dienen, um Kreuzkontaminationen zu erkennen.- Schließen Sie die Vorbereitung vor dem Lauf wie oben beschrieben ab, wobei die controller_manifest und robot_method für eine effektive Verdünnungsrate von 1 Volumen/h eingerichtet sind, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6 dargestellt. Stellen Sie sicher, dass die Heizungen für eine Zieltemperatur von 37 °C eingeschaltet sind.
- Verbinden Sie die "Bakterien in"-Leitung mit der ausgewählten Quelle von Log-Phase-Bakterien.
- Öffnen Sie die Befehlszeile im entsprechenden Verzeichnis.
- Rufen Sie das Robot-Methodenprogramm mit Python mit dem neuen Run-Flag (py robot_method.py --new) auf und geben Sie die angeforderten Argumente ein, wie zuvor in Abschnitt 4.1.4 beschrieben.
- Wählen Sie die Schaltfläche PLAY oben links im Fenster Robot Run Control , die sich öffnet, wenn das Programm ausgeführt wird, sobald Argumente angegeben wurden.
- Führen Sie die Methode vor der Zugabe von Bakteriophagen 2-3 Stunden lang durch, um das Volumen und die Bakterien-OD in den Lagunenplatten auszugleichen.
- Die With-Phagen-Lagunen mit 106 pfu/ml Bakteriophagen am Ende eines Laufzyklus impfen, wenn das Programm schläft (z. B. 5,5 μl Phagen-Aliquot bei 108 pfu/ml, bestimmt durch Plaque-Assay oder qPCR), in eine 550-μl-Lagune.
- Führen Sie das Programm über Nacht aus und überprüfen Sie dann den Phagentiter in den Vertiefungen der Lagune durch Plaque-Assay oder qPCR.
Representative Results
Ergebnisse des Infektionstests
Dieser Test wird Probleme mit der Bakterienkultur, dem Klonen und Titer von Phagen, der Temperaturstabilität der Ausrüstung, den Liquid-Handling-Einstellungen und der Integration des Plattenlesers aufdecken. Ein erfolgreicher Phageninfektionstest zeigt eine klare und schnelle Phageninfektion in Lagunen, die mit Phagen geimpft wurden, und kein Signal in Lagunen ohne Phagen. Abbildung 10 zeigt einige repräsentative Ergebnisse eines Phageninfektionstests. Die experimentellen Ergebnisse können auch mit den Abbildungen 1d und 1c dieses PRANCE-Papiers8 verglichen werden, je nachdem, ob eine "heiße PRANCE"-Konfiguration (gefüttert von einem lebenden bakteriellen Turbidostat) oder "kühles PRANCE" (gefüttert von einer gekühlten Mid-Log-Phase-Kultur) implementiert wird. Dieser Test kann mehrere häufige Probleme aufdecken. Probleme bei der Vorbereitung der Bakterienkultur können oft zu einer schwachen oder fehlenden Infektion führen. Bakterien können nur dann optimal mit M13-Phagen infiziert werden, wenn sie sich in der Mid-Log-Phase und bei 37 °C befinden. Bei anderen Temperaturen und Wachstumsstadien zeigen sie eine schwächere Pilus-Expression und sind daher weniger anfällig für Phageninfektionen12. Die Inokulation mit Phagen mit niedrigem Titer oder Phagen mit Mutationen der Wirbelsäule kann zu einem verzögerten oder fehlenden Signal führen. Probleme mit den Verstärkungseinstellungen des Plattenlesers für Fluoreszenz oder Lumineszenz werden durch diesen Test aufgedeckt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des genetischen Schaltkreises, der während des Infektionstestlaufs des PRANCE-Geräts abläuft. Wenn die T7-RNA-Polymerase, die im Phagengenom kodiert ist, den Escherichia coli-Wirt infiziert, wird sie transkribiert und bindet am AP am T7-Promotor, was zur Transkription des pIII-Phagenproteins und des luxAB-Proteins führt, was wiederum die Phagenvermehrung und die Produktion von Lumineszenz erleichtert. Abkürzungen: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; AP = akzessorisches Plasmid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ein Schema der physikalischen Komponenten des PRANCE-Systems. Ein Kühlschrank speichert gerührte Kulturen, die dann von einer Reihe von Pumpen auf das Roboterdeck in das Bakterienreservoir, die "Waffel", gebracht werden. Der Liquid-Handling-Roboter wird verwendet, um Bakterienkulturen mit dem Pipettierkopf von der "Waffel" zu den Warmhaltevertiefungen zu bringen, um sich auf Inkubationstemperatur aufzuwärmen, und dann zu den Lagunen, in denen die Hauptinkubation stattfindet. Sowohl die Auffangwells als auch die Lagunen sind Standard-2-ml-Deep-Well-Platten. Der Roboter entnimmt Proben in Einweg-Leseplatten, die wiederum zur Messung zu einem Plattenleser bewegt werden. Abkürzung: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der PRANCE-Roboterapparat. (A) PRANCE-Aufbau. (I) HEPA-Filter und externe Heizung. (II) Kulturkühlschrank. (III) Hauptgehäuse des Roboters. (IV) Plattenleser. (V) Pumpen und Tanks. (B) Robotergehäuse. (VI) Hauptkulturpumpen. (VII) Wasser-, Abfall- und Bleichtanks. VIII) Waschpumpen. (C) Robotergehäuse. (IX) Roboter-Pipettierarm und -greifer. (X) Pipettenspitzen. (XI) 3D-gedruckte Komponente, um die Kulturverteilung auf dem Roboter zu ermöglichen ("die Waffel"). (XII) Platten für die Probenahme im Plattenlesegerät. (XIII) Eimer zum Waschen von Spitzen. (XIV) "Lagunen": Kulturgefäße, in denen evolutionäre Kultivierung stattfindet. Abkürzungen: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; HEPA = hocheffiziente Partikelluft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Deck-Layout. (A) 3D-Darstellung des Deck-Layouts in der Robotersteuerungssoftware. (B) Foto der Deckskomponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Screenshot der Kommandozeile mit Beispielparametern (oben) und Run-Control-Software (unten). Der Play-Button befindet sich oben links und kann je nach lokaler Implementierung mit der Maus angeklickt oder mit einem Touchscreen betätigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Die Controller-Manifestdatei, wie sie für Testläufe konfiguriert ist. Lagunen, die Kultur #0 enthalten, befinden sich in den Spalten 1 und 3 der 96-Tiefbrunnenplatte. Die verbleibenden Spalten wären leer. Die Zeilen A, B, D und E der 96-Deep-Well-Platte sind in der rechten Spalte für eine Infektion durch Phagen (1) markiert, die anderen Zeilen (0) sind No-Phagen-Kontrollen. Diese Instanz des Controller-Manifests würde dazu führen, dass das Programm die Lagune in jedem Zyklus mit 210 μl Kultur verdünnt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Berechnung der effektiven Verdünnungsrate der Lagune mit der DilutionCalculator-Tabelle. Siehe Zusatzdatei 2 für die DilutionCalculator-Tabelle. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, entspricht eine 550-μl-Lagune, die alle 30-Minuten-Zyklen mit 210 μl Frischkultur verdünnt wird, wobei alle vier Zyklen 150 μl-Proben für die Messung der Leseplatte entnommen werden, einer effektiven Verdünnungsrate von 1,0 Lagunenvolumina/h (nach jeweils 1 Stunde verbleiben 50 % der ursprünglichen Lagunenflüssigkeit zu Beginn der Stunde) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon anzuzeigen Abbildung.
Abbildung 8: Roboterheizungssystem. Die Heizung wird durch Anschließen des Netzteils aktiviert, wie durch den roten Kreis angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Einstellungen des UV-Dekontaminationsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Messung eines Infektionstests, der auf dem PRANCE-System durchgeführt wurde. Während des Laufs werden Proben entnommen und Messungen der Lumineszenz und Absorption durchgeführt. Für jede Lagune werden die Lumineszenzmessungen durch die entsprechende Absorptionsmessung geteilt und als Funktion der Zeit aufgetragen. Die Lagunen, die mit Phage infiziert wurden, sind grün gefärbt, während die nicht infizierten Kontrolllagunen schwarz gefärbt sind. Abkürzung: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: STL-Datei für den 3D-Druck der erforderlichen kundenspezifischen Deckkomponenten für das PRANCE-System, einschließlich mindestens des Bakterienreservoirs/des Verteilers ("Waffel"). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: DilutionCalculator Spreadsheet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Trotz der Bemühungen, die Geräte zu standardisieren, wird praktisch jedes PRANCE-Setup aufgrund von Änderungen in der Geräteversorgung, der Hardware- und Softwareversionierung anders sein. Infolgedessen weist jedes PRANCE-Setup einzigartige Setup-Herausforderungen auf, die ein umfassendes Verständnis des Zwecks jeder Komponente für eine effektive modulare Fehlerbehebung erfordern.
Diese Methode beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Aufbau und Test eines etablierten PRANCE-Systems. Wir konzentrieren uns zunächst auf die kritischen Elemente der Hard- und Software und beschreiben dann die wesentlichen Schritte zur Vorbereitung und Durchführung einer Reihe von Testläufen, die feststellen, dass das System für PRANCE bereit ist.
Ein wesentliches Merkmal der Hardware ist die Optimierung, um das Risiko einer Kreuzkontamination von Proben bei Multiplex-Experimenten mit Bakteriophagen zu reduzieren. Es wird empfohlen, ausschließlich gefilterte Spitzen mit Roboterspitzentechnologie zu verwenden, die mit der Wiederverwendung von Spitzen kompatibel ist und Aerosole minimieren soll, die beim Spitzenauswurf entstehen, indem kraftschlüssige Spitzen vermieden werden. Robustes Waschen von Spitzen gemäß diesem Protokoll ermöglicht die Wiederverwendung von Spitzen, obwohl die Angemessenheit im Rahmen des Infektionstests auf jedem System validiert werden muss. Die Selbststerilisation ist auch von einer gleichmäßigen Zufuhr von Wasser und Bleichmittel für das System abhängig. Diese werden in Tanks/Eimern gelagert und führen bei Erschöpfung zu einer beeinträchtigten Selbststerilisation und einer schnellen Kreuzkontamination. Es können Fotos von den Tanks/Eimern gemacht werden, die vor und nach dem Ausführen des Programms aufgenommen wurden, um die Rate zu bewerten, mit der die Waschanlage bei einer bestimmten Pumpenkonfiguration Wasser und Bleichmittel verbraucht.
Ein weiteres Schlüsselelement des Systems ist die Aufrechterhaltung der Bakterienwachstumsphase und -temperatur. PRANCE-Experimente werden mit dem Bakterienstamm S2060 E. coli (Addgene: #105064) durchgeführt. Dies ist ein von K12 abgeleiteter F-Plasmid-haltiger Stamm, der für die Reduzierung von Biofilmen optimiert ist7. Darüber hinaus wurde das F-Plasmid in diesem Stamm mit einer Tetracyclin-Resistenzkassette zur Plasmiderhaltung, luxCDE und luxR zur Ergänzung der luxAB-vermittelten Lumineszenzüberwachung sowie lacZ unter dem Phagenschockpromotor zur kolorimetrischen Visualisierung von Plaques editiert. Der F-Plasmid-kodierte F-Pilus ist für die M13-Phageninfektion notwendig. Die in PACE verwendeten Bakterien müssen daher bei 37 °C und in der Mid-Log-Phase kultiviert werden, wenn der F-pilus12 exprimiert wird und eine M13-Phageninfektion, -vermehrung und -evolution möglich ist. Zur statischen Temperaturregelung kann ein handelsüblicher beheizter Plattenträger eingesetzt werden. Eine Alternative besteht darin, die Luft, die in den HEPA-Filter strömt, einfach mit kostengünstigen Heizungen zu erhitzen, obwohl dies nicht empfohlen wird, da dies zu einem beschleunigten Verschleiß der Hardware führen kann. Darüber hinaus beschleunigt dies die Verdunstung von Hilfsflüssigkeiten an Deck, wie z. B. den Bleich-/Wassereimern und dem Induktor, wenn sie verwendet werden.
Die Kalibrierung der Softwarepakete ist ebenfalls für die ordnungsgemäße Funktion des Systems unerlässlich. Abweichungen zwischen dem Layout des Softwaredecks und dem tatsächlichen Roboterdeck sind die häufigste Ursache für Systemausfälle während des Betriebs. Eine regelmäßige Kalibrierung der Hilfspumpen, die Bakterienkulturen, Bleichmittel und Entleerungen des Systems liefern, ist von entscheidender Bedeutung, da die Verwendung der Schlauchpumpe zu Schlauchverschleiß und Änderungen des Flüssigkeitsvolumens führen kann.
Der Wasserlauftest wird schnell eine Reihe häufiger Setup-Probleme aufdecken, darunter falsche Liquid-Handling-Einstellungen, Fluidiklecks/fehlerhafte Verbindungen und Software-Instabilität. Ein erfolgreicher Wasserlauf weist keine unerwarteten Flüssigkeitslecks auf und läuft über Nacht stabil und fehlerfrei. Es gibt eine Reihe von häufigen Problemen, die während eines Wasserlaufs auftreten können, wie z. B. das Nichtausführen bestimmter Schritte zur Handhabung von Flüssigkeiten, das Tropfen von Pipetten und das Anhalten des Protokolls während des Laufs. Falls bestimmte Liquid-Handling-Schritte nicht ausgeführt werden, vergewissern Sie sich, dass alle Flüssigkeitsklassen installiert wurden. Diese listen die passende Viskosität und Pipettiergeschwindigkeiten auf und werden in der vom Hersteller bereitgestellten Robotersteuerungssoftware eingestellt. Wenn Pipetten tropfen, ist es wichtig, dass die Einstellungen des Roboter-Pipettierarms korrekt sind, um ein sauberes Pipettieren zu ermöglichen und eine Phagen-Kreuzkontamination zu vermeiden. Für ein erfolgreiches Roboterpipettieren sind neben den korrekten Flüssigkeitsklassen auch die korrekten Deckhöhen aller Laborgeräte und entsprechende Pipettierhöhenversätze erforderlich, die im PRANCE-Robotermethodenprogramm festgelegt sind. Diese Höhenversätze müssen möglicherweise direkt angepasst werden. Wenn das Protokoll während des Durchlaufs stoppt, wird dies häufig durch eine Vielzahl von Fehlern generiert, die darauf hinweisen, dass die Deck-Layout-Datei möglicherweise nicht mit der tatsächlichen Deck-Konfiguration übereinstimmt.
Der reine Bakterientest wird Probleme mit den Einstellungen des Plattenlesers und der Echtzeit-Datenvisualisierung, Probleme mit übermäßiger Bleichmittelkonzentration oder unzureichender Spülung sowie Temperaturstabilität aufdecken. Ein erfolgreicher Lauf nur mit Bakterien zeigt eine Äquilibrierung der Lagunenabsorption über die ersten drei Zyklen, gefolgt von einer stabilen Absorption für die Dauer des Laufs. Darüber hinaus kann es mehrere häufige Probleme aufdecken. Dies ist der erste Schritt, in dem die vom Plattenleser generierten Daten aufgetragen werden. Daten in der Plattenleser-Datenbank werden möglicherweise nicht richtig gespeichert oder nicht richtig dargestellt. Wenn Bakterien ihre Absorption nicht ausgleichen, kann dies darauf hindeuten, dass die Bleichmittelkonzentration zu hoch ist. Übermäßiges Bleichen oder unzureichendes Waschen kann das gesamte Experiment sterilisieren und nicht nur das Laborgerät. Bei Verdacht darauf können Bleichmittel-Erkennungsstreifen verwendet werden, um die Lagune zu testen. Die Temperaturstabilität der Kultur kann mit einer Thermometerpistole überprüft werden.
Ein erfolgreicher Infektionstest zeigt an, dass das System für PRANCE-Läufe bereit ist. Ein Infektionstest kann durchgeführt werden, indem eine Untergruppe von Lagunen geimpft wird, die Bakterienkulturen enthalten. Diese Bakterien exprimieren pIII, wenn sie mit dem entsprechenden Phagen infiziert werden, dem das Gen für pIII (ΔgIII) fehlt, was eine Phagenvermehrung ermöglicht. Eine mögliche Kombination für Tests besteht darin, S2060-Bakterien zu verwenden, die mit einem Plasmid, das pIII exprimiert, unter dem Phagen-Schock-Promotor mit einem beliebigen ΔgIII-Phagen transformiert wurden. Wir empfehlen die Verwendung von ΔgIII-Phagen mit der Wildtyp-T7-RNA-Polymerase mit S2060-Bakterien, die mit einem akzessorischen Plasmid transformiert wurden, bei dem pIII und luxAB vom T7-Promotor (Plasmid pJC173b13) angetrieben werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dies ermöglicht auch eine Plattenleser-vermittelte Überwachung der Infektion während des Testlaufs. Ein endgültiger Beweis für den Erfolg des Infektionstests und das Fehlen einer Kreuzkontamination wird durch Phagentitering von Test- und Kontrolllagunen erbracht. Wenn ein Luciferase-Reporter verwendet wird, ist eine Zunahme der Lumineszenz nur in Testvertiefungen, wie in Abbildung 3 zu sehen, ebenfalls ein Indikator für eine erfolgreiche Phageninfektion und -vermehrung. Der Goldstandard für die Quantifizierung von Phagentitern ist der Plaque-Assay7. Es gibt auch ein Protokoll für die M13-Quantifizierung durch qPCR7 , das möglicherweise schneller ist, obwohl es nicht zwischen infektiösen und nicht-infektiösen Phagenpartikeln unterscheidet und daher die Titer überschätzen kann.
Das Hauptprogramm verweist auf eine Manifestdatei, dies ist eine Klartext-Datenbankdatei, die das Verdünnungsvolumen pro Zyklus jeder Vermehrungskultur sowie die Auswahl einer beliebigen Anzahl potenzieller Bakterienkultur-Rohstoffe vorgibt, die sich in der Auswahlstrenge unterscheiden können. Auf diese Weise definiert die Manifestdatei viele der Parameter der PRANCE-Ausführung. Es ist zu beachten, dass diese Datei während des Laufs entweder vom Bediener oder vom System bearbeitet werden kann, was bedeutet, dass eine manuelle oder automatische Rückkopplungssteuerung erfolgen kann.
Der Nutzen eines voll funktionsfähigen PRANCE-Setups liegt in seiner Fähigkeit, große Populationen in einer sorgfältig überwachten und kontrollierten Umgebung schnell zu entwickeln. Das plattenbasierte Format unterscheidet PRANCE von anderen Techniken, wie z. B. der Verwendung kleinerer handelsüblicher Systeme auf Turbidostatenbasis 14,15. Der plattenbasierte Aufbau ermöglicht nicht nur die einfache Integration mit zusätzlichen Roboterbearbeitungsschritten, sondern auch die Kompatibilität mit anderen Laborgeräten wie Zentrifugen. Darüber hinaus führt die Fähigkeit, eine beschleunigte Evolution gleichzeitig über mehrere Instanzen hinweg durchzuführen, dem Experiment eine zusätzliche Dimension ein, die die Aussicht auf vielfältige und robuste Ergebnisse erhöht. Das granulare Steuerungs- und Feedbacksystem, das in PRANCE integriert ist, stärkt die Vorhersagbarkeit und Zuverlässigkeit des Experiments weiter und stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der gerichteten Evolutionstechniken dar. Diese Technik ist jedoch in der Anzahl der parallelen Experimente, die sie durchführen kann, begrenzt. Je nach Konfiguration sind PRANCE-Setups in der Regel entweder durch die Pipettiergeschwindigkeit des Roboters oder durch den verfügbaren Platz an Deck begrenzt.
Die gleiche Hard- und Software, die für PRANCE verwendet wird, kann auch auf Evolutionsmethoden angewendet werden, die keine Bakteriophagen beinhalten. Wie in der Many-Turbidostats-Methode11 gezeigt, kann dasselbe Instrument ausschließlich mit Bakterien eingesetzt werden, was Experimente zur adaptiven Evolution des gesamten Genoms ermöglicht. Diese Anpassungsfähigkeit erweitert den Anwendungsbereich dieses Instruments und ebnet den Weg für neue Formen der roboterbeschleunigten Evolution.
Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Emma Chory und Kevin Esvelt für ihre Hilfe und Beratung bei der Einrichtung von Hard- und Software. Samir Aoudjane, Osaid Ather und Erika DeBenedictis werden durch den Steel Perlot Early Investigator Grant unterstützt. Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute unterstützt, das seine Grundfinanzierung von Cancer Research UK (CC2239), dem UK Medical Research Council (CC2239) und dem Wellcome Trust (CC2239) erhält.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed bacterial reservoir "waffle" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
| 3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
| 3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
| 8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
| 96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
| Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
| Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
| Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
| encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
| Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
| HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
| iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
| laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
| luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
| Magnetic stir plate | Camlab | SKU - 1189930 | For Auxiliary Fridge |
| Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
| Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
| One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
| pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
| Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
| S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
| temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
| Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
| Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
| Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
| Suggested pump manufacturers | |||
| Company | Catalog number | Notes | Documentation |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
References
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- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
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