Analyse qualitative et quantitative de la production de sidérophores à partir de Pseudomonas aeruginosa
Summary
Ce protocole fournit des analyses qualitatives et quantitatives des sidérophores totaux, de la pyoverdine et de la pyochéline de Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est connu pour sa production d’un large éventail de facteurs de virulence pour établir des infections chez l’hôte. L’un de ces mécanismes est le piégeage du fer par la production de sidérophores. P. aeruginosa produit deux sidérophores différents : la pyochéline, qui a une affinité plus faible pour chélateur du fer, et la pyoverdine, qui a une affinité plus élevée pour la chélation du fer. Ce rapport démontre que la pyoverdine peut être directement quantifiée à partir de surnageants bactériens, tandis que la pyochéline doit être extraite des surnageants avant d’être quantifiée.
La principale méthode d’analyse qualitative de la production de sidérophores est le dosage sur plaque de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS). Dans ce test, la libération du colorant CAS du complexe Fe3+-Dye conduit à un changement de couleur du bleu à l’orange, indiquant une production de sidérophore. Pour la quantification des sidérophores totaux, les surnageants bactériens ont été mélangés en proportions égales avec le colorant CAS dans une plaque de microtitration, suivis d’une analyse spectrophotométrique à 630 nm. La pyoverdine a été directement quantifiée à partir du surnageant bactérien en la mélangeant dans des proportions égales avec 50 mM de Tris-HCl, suivie d’une analyse spectrophotométrique. Un pic à 380 nm a confirmé la présence de pyoverdine. En ce qui concerne la pyochéline, la quantification directe à partir du surnageant bactérien n’était pas possible, il a donc fallu d’abord l’extraire. L’analyse spectrophotométrique ultérieure a révélé la présence de pyochéline, avec un pic à 313 nm.
Introduction
Les organismes ont besoin de fer pour remplir diverses fonctions vitales, telles que le transport d’électrons et la réplication de l’ADN1. Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène opportuniste à Gram négatif, est connu pour posséder une variété de facteurs de virulence pour établir l’infection chez l’hôte, dont l’un des mécanismes est la formation de sidérophores2. Dans des conditions d’appauvrissement en fer, P. aeruginosa libère des molécules spécialisées appelées sidérophores, qui éteignent le fer de l’environnement environnant. Les sidérophores chélatent le fer de manière extracellulaire, et le complexe ferric-sidérophore qui en résulte est activement transporté vers la cellule3.
P. aeruginosa est connu pour produire deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline. La pyoverdine est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus élevée (1 :1), tandis que la pyochéline est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus faible (2 :1)4. La pyochéline est également appelée sidérophore secondaire car elle a uneaffinité chélatrice de fer 5 plus faible. La production et la régulation des sidérophores sont activement contrôlées par les systèmes de détection de quorum (QS) chez P. aeruginosa6.
Outre la trempe du fer, les sidérophores sont également impliqués dans la régulation des facteurs de virulence et jouent un rôle actif dans la formation du biofilm7. Les sidérophores jouent d’autres rôles cruciaux, notamment l’implication dans la signalisation cellulaire, la défense contre le stress oxydatif et la facilitation des interactions entre les communautés microbiennes8. Les sidérophores sont généralement classés en fonction des groupes fonctionnels spécifiques à travers lesquels ils chélatent le fer. Les trois principaux ligands bidentates de cette classification sont le catécholate, l’hydroxamate et le α-hydroxycarboxylate3. Les pyoverdines sont des caractéristiques d’espèces fluorescentes de Pseudomonas telles que P. aeruginosa et P. fluorescens5. Ils sont constitués d’un chromophore fluorescent vert mixte couplé à un oligopeptide contenant 6 à 12 acides aminés. Plusieurs peptides synthétases non ribosomales (PNR) sont impliquées dans leur synthèse9. Quatre gènes impliqués dans la production et la régulation de la pyoverdine sont pvdL, pvdI, pvdJ et pvdD10. La pyoverdine est également responsable de l’infection et de la virulence chez les mammifères11. P. aeruginosa est connu pour produire de la pyochéline dans des conditions modérées de limitation du fer, tandis que la pyoverdine est produite dans des environnements sévères limitant le fer12. Deux opérons impliqués dans la production de pyochéline sont pchDCBA et pchEFGHI13. Il est à noter qu’en présence de pyocyanine, la pyochéline (catécholate) induit des dommages oxydatifs et une inflammation et génère des radicaux hydroxyles, qui sont nocifs pour les tissus de l’hôte11.
Le test du sulfonate de chrome-azurol (CAS) est largement adopté en raison de son exhaustivité, de sa grande sensibilité et de sa plus grande commodité par rapport aux tests microbiologiques, qui, bien que sensibles, peuvent être trop spécifiques14. Le test CAS peut être effectué sur des surfaces gélosées ou dans une solution. Il s’appuie sur le changement de couleur qui se produit lorsque l’ion ferrique passe de son complexe bleu intense à l’orange. Le test colorimétrique CAS quantifie l’épuisement du fer d’un complexe ternaire tensioactif Fe-CAS. Ce complexe particulier, composé de métal, de colorant organique et de tensioactif, a une couleur bleue et présente un pic d’absorption à 630 nm.
Ce rapport présente une méthode de détection qualitative de la production de sidérophores, où l’on peut détecter la production de sidérophores sur une plaque de gélose. Une méthode d’estimation quantitative de la production totale de sidérophores dans une plaque de microtitration et la détection et l’analyse quantitative de deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline, de P. aeruginosa, sont également fournies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier les sidérophores totaux et deux sidérophores différents de P. aeruginosa, à savoir la pyoverdine et la pyochéline, à partir du surnageant bactérien acellulaire. Dans le test des plaques de gélose CAS, le colorant CAS et les ions Fe3+ forment un complexe. Lorsque les bactéries produisent des sidérophores, elles éteignent les ions Fe3+ du complexe CAS-Fe3+, ce qui entraîne un changement de couleur autour de la croissance …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le financement du programme d’enseignement de la biotechnologie (TCD), du programme BUILDER (TCD) et du programme FIST. MR remercie la bourse reçue de SHODH. HP remercie la bourse reçue du CSIR.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
Riferimenti
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biologia. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
