Summary
Aqui, apresentamos o primeiro protocolo de infiltração localizada a vácuo para estudos in vivo da transformação genética de plantas de grande porte. Utilizando esta metodologia, obteve-se pela primeira vez a transformação transitória do cacau mediada por Agrobacterium em planta.
Abstract
A transformação transitória em plantas é uma alternativa rápida e econômica para a transformação genética de plantas. A maioria dos protocolos para transformação in planta depende do uso de transformação mediada por Agrobacterium. No entanto, os protocolos atualmente em uso são padronizados para plantas de pequeno porte devido às restrições físicas e econômicas de submeter plantas de grande porte a um tratamento a vácuo. Este trabalho apresenta um protocolo eficaz para agroinfiltração localizada a vácuo customizada para plantas de grande porte. Para avaliar a eficácia do método proposto, testou-se seu uso em plantas de cacau, uma espécie de planta tropical recalcitrante à transformação genética. Nosso protocolo permitiu aplicar até 0,07 MPa de vácuo, com repetições, em uma parte aérea localizada das folhas de cacau, tornando possível forçar a infiltração de Agrobacterium nos espaços intercelulares das folhas aderidas. Como resultado, obteve-se a transformação transitória em planta mediada por Agrobacterium de folhas de cacau anexas expressando para o sistema repórter RUBI. Esta é também a primeira Agrobacterium-mediada em planta de transformação transitória do cacau. Este protocolo permitiria a aplicação do método de agroinfiltração a vácuo a outras espécies vegetais com restrições de tamanho semelhantes e abriria as portas para a caracterização in planta de genes em espécies lenhosas recalcitrantes de grande porte.
Introduction
Métodos de transformação genética vegetal são essenciais para testar as funções biológicas dos genes e são especialmente úteis nos dias de hoje, dado o grande número de genes não caracterizados previstos na era pós-genômica1. Estes métodos podem ser usados para obter linhas totalmente transformadas ou para expressar genes transitoriamente. A transformação estável ocorre quando o DNA estranho que o hospedeiro absorveu torna-se total e irreversivelmente integrado ao genoma do hospedeiro, e as modificações genéticas são transmitidas para as gerações seguintes. A expressão transitória, conhecida como transformação transitória, ocorre a partir de múltiplas cópias de T-DNA transferidas por Agrobacterium para dentro da célula, que não foram integradas ao genoma do hospedeiro, e atinge seu pico 2-4 dias após a infecção2.
Vale ressaltar que ensaios de expressão transitória são frequentemente suficientes para a caracterização funcional de genes e podem oferecer diversas vantagens sobre a transformação estável. Por exemplo, a transformação transitória não requer procedimentos de regeneração baseados em cultura de tecidos. Outra vantagem é que é compatível com a análise funcional de genes em planta , existindo vários exemplos bem sucedidos de protocolos bem padronizados para espécies de plantas-modelo, como Arabidopsis thaliana3 e Nicotiana benthamiana4, mas ainda limitado em espécies nãomodelo5.
O desenvolvimento de ensaios transientes depende da disponibilidade de métodos eficientes de transferência gênica. Para isso, as abordagens mais populares baseiam-se na infiltração da Agrobacterium , que aproveita a capacidade única da Agrobacterium de transferir DNA para as células vegetais6. Outra ferramenta útil para essas análises é o uso de genes repórteres, como proteínas fluorescentes verdes (GFP), β-glucuronidase (GUS), luciferase ou RUBY, todos empregados para rastrear eventos de transformação. Dentre esses sistemas repórteres, o RUBY é atualmente o mais fácil de visualizar e se baseia na conversão de tirosina em betalaínas através de três reações enzimáticas de passo. Ao contrário de outros sistemas repórteres, as betalaínas resultantes podem ser prontamente observadas como pigmentos de cores vivas no tecido vegetal transformado, sem a necessidade de equipamentos sofisticados ou reagentes adicionais7.
Ao infiltrar uma suspensão de Agrobacterium no espaço intercelular do mesofilo foliar, o passo mais crítico para o sucesso da agroinfecção é a superação da barreira física imposta pela cutícula epidérmica das folhas8. Enquanto para algumas plantas um gradiente de pressão criado com uma seringa sem agulha (seringa Agroinfiltration) é suficiente para uma agroinfiltração eficiente, como ocorre em Nicotiana benthamiana9, outras espécies vegetais podem requerer um gradiente de pressão maior, como o criado com o auxílio de bombas de vácuo10. Nos processos assistidos a vácuo, a agroinfiltração ocorre em duas etapas. Na primeira, o vácuo serve para submeter o material vegetal a pressão reduzida, forçando a liberação de gases dos espaços aéreos do mesofilo através de estômatos e feridas. Em seguida, durante uma fase de repressurização, a suspensão de Agrobacterium infiltra os espaços intercelulares através dos estômatos e fere11.
Em comparação com a infiltração da seringa, a infiltração a vácuo permite maior frequência de uso, repetibilidade e a capacidade de controlar a pressão e a duração em cada estágio do processo de infiltração10. Em folhas de diferentes espécies vegetais, como espinafre (Spinacia oleracea)12, peônia (perene lenhosa) (Paeonia ostii)13 e feijão-caupi (Vigna unguiculata)14, os protocolos de agroinfiltração a vácuo alcançaram uma taxa de infiltração mais profunda do que a infiltração da seringa. Da mesma forma, em tomateiro (Lycopersicon esculentum)15 e gérbera (Gerbera hybrida)16, a agroinfiltração a vácuo produziu silenciamento gênico mais forte e uniforme do que a infiltração em seringas. Uma vantagem adicional da infiltração a vácuo é a menor dependência do genótipo, comparada à infiltração de seringas, observada recentemente em três variedades de citros (Fortunella obovata, Citrus limon e C. grandis)17. No entanto, ao tentar aplicar agroinfiltração a vácuo em plantas que são muito grandes para caber em dessecadores, o tamanho das câmaras de vácuo pode ser uma limitação, como normalmente ocorre com plantas lenhosas tropicais.
A seguir, descrevemos um protocolo que supera a limitação espacial das câmaras de vácuo, testando sua utilidade para a transformação transitória in planta de folhas de cacau. Apresentamos o primeiro método de infiltração a vácuo localizada para cacau, que não requer equipamentos adicionais e ainda permite o uso dos mesmos dessecadores de laboratório utilizados para a infiltração de toda a planta, mas com uma adaptação simples que permite o acesso de uma parte da planta dentro da câmara de vácuo, permitindo sua utilização em diferentes estágios de desenvolvimento da planta. Para testar a utilidade do método de infiltração localizada a vácuo proposto, selecionamos o cacau como proxy de uma espécie de planta tropical de folhas grandes e difícil de transformar. Usando este método de infiltração localizada, recentemente relatamos a primeira expressão transitória em planta em abacate por infiltração a vácuo mediada por Agrobacterium com condições previamente otimizadas para folhas destacadas18, e aqui relatamos a primeira expressão transitória em planta em cacau.
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Protocol
1. Cultura de Agrobacterium tumefaciens
- Descongelar células eletrocompetentes da cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
- Adicionar 1 mL de malte de levedura (YM; Tabela 1) caldo para um tubo de cultura de 17 mm x 100 mm. Guarde este tubo para mais tarde e mantenha-o à temperatura ambiente (RT).
- Em um tubo de microfuga de 1,5 mL, adicionar 30 μL das células de Agrobacterium descongeladas e 100-250 ng (até 5 μL) do DNA contendo 35S:RUBY. Misture delicadamente.
NOTA: O 35S:RUBY foi um presente de Yunde Zhao. Para evitar o arqueamento de amostras, reduza ao máximo a presença de compostos iônicos. Esses compostos iônicos podem ser sais residuais da precipitação etanólica do DNA19. - Neste ponto, coloque uma cubeta de eletroporação de 1 mm no gelo.
- Transfira a mistura de suspensão anterior para uma cubeta de eletroporação resfriada de 1 mm. Mantenha tudo no gelo. Limpe os eletrodos metálicos da cubeta.
- Ajuste o eletroporador para Agr (2,2 kV, ~5 ms, 1 pulso). Coloque a cubeta dentro da câmara de eletroporação.
- Pressione o botão Pulse . Registre os parâmetros de pulso. Se a amostra se abriu, o processo de eletroporação falhou.
NOTA: É fundamental transferir rapidamente as células para o caldo YM logo após o pulso. Atrasar essa transferência pode reduzir drasticamente a eficiência da transformação20. - Imediatamente, use o caldo YM salvo para transferir as células da cubeta para o tubo de 17 mm x 100 mm. Ressuspenda as células suavemente.
- Incubar as células transformadas durante 3 h a 28 °C e 250 rpm numa incubadora orbital.
NOTA: Esta cultura não contém antibióticos; Seja cauteloso sobre condições assépticas adequadas. - Fixar esta cultura em placas seletivas de ágar YM21. Para a cepa LBA4404-RUBI transformada, verifique se essas placas contêm rifampicina (25 μg/mL), espectinomicina (50 μg/mL) e estreptomicina (50 μg/mL). Incubar esta placa durante a noite numa incubadora permanente a 28 °C.
OBS: Neste protocolo, foi utilizado o vetor 35S:RUBI , que confere resistência bacteriana à espectinomicina (50 μg/mL) e funciona como repórter visual sobre o tecido vegetal infiltrado. - Inocular colônias da cultura noturna em 12,5 mL de uma mistura de caldo YM e caldo Luria Bertani (LB) (na proporção de 9:1, respectivamente), 10 mM de MES, pH 5,722. Certifique-se de que este meio líquido selectivo contém os mesmos antibióticos utilizados no passo 1.10. Consulte a Tabela 1 para ver os ingredientes e concentrações desses meios.
- Ao incubar Agrobacterium, deixe espaço de aeração suficiente para a cultura, cerca de 4 a 5 vezes o volume líquido. Use caldo YM para LBA4404 cepa de Agrobacterium para evitar aglomeração celular23.
- Incubar a cultura por 16 h a 250 rpm em uma incubadora orbital de 28 °C.
- Escalar a cultura até 10 vezes o volume inicial com o mesmo meio utilizado na etapa 1.11.
- Incubar a cultura por 16 h e 250 rpm em uma incubadora orbital de 28 °C.
- Ajustar a cultura noturna para uma densidade óptica (OD600) de 0,4. Adicionar 20 μM de acetoseringona (AS).
- Incubar a 250 rpm em uma incubadora orbital de 28 °C até que OD600 atinja cerca de 1,0.
- Centrifugar as células a 4 500 x g durante 10 min a 20 °C.
- Ressuspender o pellet com solução de suspensão (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7), ajustando OD600 para 0,6. Adicionar 200 μM AS24.
NOTA: Pré-incubar a solução de suspensão a 28 °C. Se a solução de suspensão estiver fria quando adicionada, as células precipitar-se-ão. - Deixar a suspensão bacteriana durante 2-24 h em condições escuras e a 25 °C. Não é necessária agitação22.
2. Seleção de plantas
- Escolha uma planta com um galho com folhas no estágio ideal para a agroinfiltração.
NOTA: A planta pode ser adulta ou uma árvore madura. Para o cacau, recomendam-se folhas jovens de estágio C. Estas folhas são de bronze a verde claro; não são totalmente expandidos nem tão rígidos quanto as folhas do estágio D25 (Figura 1).- Como controle, realizar simultaneamente a agroinfiltração em outras plantas (por exemplo, Nicotiana tabacum) com uma alta eficiência de agroinfiltração que é relatada para a linhagem e vetor usados.
NOTA: Se nenhum resultado positivo for obtido neste controle, é possível que os resultados negativos sejam devidos à cepa ou ao vetor usado.
- Como controle, realizar simultaneamente a agroinfiltração em outras plantas (por exemplo, Nicotiana tabacum) com uma alta eficiência de agroinfiltração que é relatada para a linhagem e vetor usados.
3. Configuração da câmara de vácuo
- Como uma câmara de vácuo, use um exsicador que tenha um medidor de vácuo para medir a pressão de vácuo em seu interior.
- Adicionar 250 μM de ácido jasmônico (JA)18,26 à suspensão de Agrobacterium a partir do passo 1.19.
- Transfira a cultura de Agrobacterium para um copo de boca larga para submergir o ramo e as folhas selecionados. Em seguida, coloque o copo com cultura Agrobacterium dentro do dessecador.
- Coloque o galho entre o exsicador e sua tampa. Certifique-se de submergir as folhas desejadas dentro da cultura Agrobacterium . Em seguida, use um anel de salto, que é um anel redondo com um recorte que permite que o ramo da planta entre no dessecador. O Jump Ring também atua como um espaçador entre a parte inferior e superior do Dessecador.
- Certifique-se de que a junta é estruturalmente estável o suficiente para evitar ser esmagada com a tampa, flexível o suficiente para dobrar e ajustar à circunferência do dessecador, e não feita de um material poroso.
OBS: Este estudo utilizou um fio metálico encordoado constituído por vários fios menores torcidos entre si, revestidos com um material plástico não poroso semelhante a uma junta (Figura 2). - Para fixar o ramo no dessecador, use material de moldagem de silicone. Certifique-se de que o material é pegajoso, não poroso, quimicamente inerte ao exsicador e à planta, e fácil de aplicar e preencher pequenas lacunas entre o ramo, a junta e o dessecador.
- Uma vez que o material de impressão de silicone polimeriza (isso leva cerca de 1 min) e fixa o ramo no lugar, feche o dessecador. Certifique-se de não deixar lacunas.
- Conecte o exsicador à bomba de vácuo (Figura 3).
4. Infiltração a vácuo
- Ligue a bomba de vácuo até atingir -0,07 MPa.
- Quando atingir essa pressão, feche a válvula de pressão e desligue a bomba de vácuo. Mantenha essa pressão por 5 min.
- Abra a válvula de pressão para restaurar a pressão da câmara.
Observação : esta é uma etapa crítica. Restaure a pressão da câmara de forma gradual e constante. Pode levar até 3 minutos para repressurizar totalmente o dessecador. A repressurização prolongada aumenta o número de bactérias infiltradas no interior do tecido10. - Repita esse processo mais duas vezes.
- Retire o ramo da suspensão celular e do dessecador.
- Limpe as folhas infiltradas com água destilada.
5. Incubação das folhas infiltradas
- Deixe as folhas infiltradas permanecerem no escuro a 25 °C por 48 h.
- Em seguida, expor o tecido infiltrado a um fotoperíodo claro/escuro de 16/8 horas.
- Avaliar a transformação foliar transitória 3-7 dias pós-infecção (IPS).
Figura 1: Fases de desenvolvimento das folhas do cacau. (A-E) Estágios de desenvolvimento25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração da câmara de vácuo e seus componentes. A câmara de vácuo é um exsicador conectado a um medidor de vácuo. A junta / O-ring é cortada para que tenha uma abertura onde o ramo será colocado. (A) Medidor de vácuo, (B) Tampa, (C) Junta/O-ring, (D) Válvula de pressão, (E) Dessecador, (F) Mangueira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Sistema de agroinfiltração a vácuo in planta . Para evitar perdas de vácuo durante o processo de infiltração, é fundamental fixar o ramo ao exsicador e à junta/O-ring com material de moldagem de silicone. (A) Cacau, (B) Câmara de vácuo, (C) Material de impressão de silicone, (D) Folhas submersas em suspensão de Agrobacterium , (E) Bomba de vácuo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Este protocolo apresenta um método eficaz de agroinfiltração para plantas lenhosas de grande porte. Com este protocolo, conseguimos atingir uma pressão de vácuo de -0,07 MPa, resultando na infiltração efetiva e localizada das folhas do cacau. Na Figura 4, observa-se o processo de montagem do sistema de infiltração e, na Figura 5, a configuração final.
Figura 4: Configuração da câmara de vácuo. (A) Observe a colocação do ramo entre as duas extremidades da junta. Esta junta é grande o suficiente para permitir que o ramo passe entre o exsicador e sua tampa. Observe que há lacunas formadas devido à superfície irregular do ramo. (B) O ramo é fixado no dessecador, e as lacunas formadas são preenchidas com o material de impressão de silicone. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Configuração do sistema de infiltração a vácuo. Exemplo da configuração do sistema de infiltração a vácuo para uma planta de cacau de grande porte utilizando o protocolo proposto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Durante o primeiro estágio da agroinfiltração, o tecido é submetido à redução da pressão, o que faz com que gases sejam liberados das cavidades estomáticas e dos espaços aéreos adjacentes do mesofilo através dos estômatos e através das feridas. Pequenas bolhas na superfície das folhas imersas na suspensão de Agrobacterium podem ser vistas a olho nu à medida que o vácuo aumenta. O próximo passo é repressurizar os tecidos e forçar a suspensão da Agrobacterium em seu interior para preencher o vazio deixado pelo ar11. As folhas infiltradas aparecem de coloração mais escura em algumas áreas (Figura 6). Isso indica que a suspensão de Agrobacterium penetrou no tecido e se espalhou por toda parte, preenchendo os espaços intercelulares da folha8.
Figura 6: Vista abaxial das folhas adultas de cacau após o término da agroinfiltração a vácuo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Esse protocolo possibilitou a agroinfiltração em folhas localizadas de plantas de cacau de grande porte. Ao fazer isso, transformamos transitoriamente grandes plantas de cacau com um vetor carregando 35S:RUBY como um sistema repórter. Achamos este sistema repórter um indicador útil de transformação transitória bem-sucedida em cacau, porque o acúmulo de betalaínas nas folhas indica a eficiência da transformação. As betalaínas são pigmentos vermelhos vivos, produzindo um sinal inconfundível nas folhas verdes que pode ser observado a olho nu (Figura 7). Como as folhas estão aderidas à planta, as betalaínas podem se acumular se o tecido infiltrado mantiver sua viabilidade. A Figura 8 mostra uma série de resultados, variando de um alto a baixo acúmulo de betalaína nas folhas de cacau transformadas do estágio C. Vale ressaltar que esta é a primeira transformação transitória em planta relatada nesta espécie.
Figura 7: Folhas de cacau transitoriamente transformadas em superexpressas 35S: RUBY. As manchas vermelhas nas folhas do cacau resultantes do acúmulo de betalaína são uma maneira simples e rápida de avaliar o protocolo proposto de agroinfiltração localizada a vácuo em planta. Imagem a 6 DPI, barra de escala: 1 cm, zoom óptico: 8x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Acúmulo de betalaína nas folhas do cacau. Diferentes níveis e padrões de acúmulo de betalaína em folhas de cacau a 6 DPI por transformação transitória mediada por Agrobacterium com o repórter RUBI. Barra de escala: 1 cm, Zoom óptico: 8x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| LB Médio | YM Médio | |
| Extrato de levedura | 5 g/L | 0,4 g/L |
| Digestão enzimática de triptona da caseína | 10 g/L | |
| NaCl | 5 g/L | 0,1 g/L |
| Manitol | 10 g/L | |
| MgSO4·7h20 | 0,204 g/L | |
| K2HPO4 | 0,38 g/L | |
| MES | 1,95 g/L (10 mM) | 1,95 g/L (10 mM) |
| MgCl2 |
Tabela 1: Composição dos meios YM e LB.
Figura suplementar 1: Imagem representativa da agroinfiltração forçada em folhas de cacau usando uma seringa sem agulha. A infiltração da seringa não resultou na expressão de RUBI nas folhas visíveis a olho nu, mas resultou em danos no ponto em que a pressão foi aplicada com a seringa sem agulha. Imagem a 6 DPI, barra de escala: 5 mm, zoom óptico: 25x. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Neste trabalho, apresentamos um protocolo de agroinfiltração eficiente e de baixo custo para a transformação transitória in planta de plantas lenhosas, usando como exemplo plantas de cacau. Dada a conhecida restrição que a cutícula das folhas representa para a transformação dos tecidos vegetais, concentramo-nos no desenvolvimento de uma estratégia para facilitar a agroinfiltração por vácuo em plantas lenhosas, que geralmente são recalcitrantes a esse procedimento.
A pressão de vácuo alcançada dentro da câmara de vácuo só foi possível devido à eficiente vedação e preenchimento das pequenas lacunas criadas entre o dessecador, o galho da árvore, a junta/O-ring e a tampa do dessecador, que foi o principal desafio do protocolo. Por esse motivo, é fundamental utilizar material de moldagem de silicone para fixar o ramo no dessecador. Este material não é poroso, mostra-se pegajoso o suficiente para aderir o ramo ao exsicador e à junta, e é quimicamente inerte, de modo que nem o ramo infiltrado nem o exsicador são danificados.
Além disso, é necessário o uso de uma bomba de vácuo para obter um gradiente de pressão dentro da seção foliar, fazendo com que o ar seja sugado para fora da cavidade estomática e regiões do mesofilo, então um grande gradiente de pressão durante a repressurização empurra a suspensão de Agrobacterium para dentro da folha através de estômatos e feridas10. Utilizou-se liofilizador como bomba de vácuo. Este é um exemplo da versatilidade e adaptabilidade deste protocolo às necessidades de cada laboratório. Usando o liofilizador como bomba de vácuo, levou cerca de 3 minutos para atingir -0,07 MPa. Isso é efetivo para o cacau, uma vez que autores anteriores também infiltraram a vácuo folhas destacadas de cacau com a mesma pressão de vácuo25. Este é o método de infiltração preferido, pois é mais repetível do que a infiltração de seringa não assistida ou sem agulha (Figura 1 Suplementar). Ao utilizar uma bomba de vácuo para infiltração de vácuo, o usuário pode controlar a pressão e o tempo que os tecidos ficam expostos ao vácuo10.
Em outras plantas, como o álamo, tem sido estudado que a estrutura foliar pode afetar a eficiência da infiltração devido ao arranjo das células do mesofilo. Os diferentes e variáveis arranjos dessas células podem resultar em infiltração irregular pela suspensão de Agrobacterium 8,27, uma vez que a estrutura interna da folha apresenta lacunas de ar intercelulares8. Embora a infiltração espontânea através dos estômatos das folhas possa ocorrer ao submergir as folhas em uma suspensão de Agrobacterium, a pressão atmosférica não é eficaz o suficiente para superar a cutícula epidérmica e deslocar esses espaços aéreos com a suspensão bacteriana; isso tem sido tentado com outras espécies recalcitrantes, como Persea americana18. Por essa razão, a agroinfiltração forçada mediada por vácuo mostra-se um método eficiente para facilitar a penetração da substância nas folhas através dos estômatos ou feridas10. A inoculação de mudas jovens de cacau com o clone infeccioso do vírus Gana M do vírus do cacau inchado por inoculação biolítica e agroinoculação foi recentemente relatada28. No cacau, a maioria dos ensaios de transformação transitória é realizada em folhas destacadas25,29, resultando em redução da absorção da expressão transitória devido à degradação do material vegetal. Até onde sabemos, não há relatos de transformação genética transitória em plantas de cacau. Aqui, conseguimos a primeira transformação transitória do cacau e, anteriormente, nosso mesmo grupo de estudo conseguiu isso em Persea americana18, tornando esta uma metodologia viável para possíveis análises in vivo localizadas de metabólitos ou moléculas que são expressas apenas nas folhas.
A transformação transitória com o vetor 35S:RUBI foi confirmada pela expressão transitória de betalaínas nas folhas do cacaueiro. Este vetor reconstitui a via biossintética da betalaína em plantas que não produzem naturalmente esses pigmentos. Apenas algumas cariofilales podem biossintetizar naturalmente betalaínas a partir de tirosina com suas próprias vias metabólicas30. Para replicar esse metabolismo, o 35S:RUBI contém a informação genética para a expressão heteróloga de três enzimas que convertem o aminoácido tirosina comumente presente em betalaínas7.
In planta , os protocolos de transformação transitória têm muitas vantagens sobre os protocolos de transformação estáveis, incluindo mais rápido, econômico e maior eficiência de transformação31. Além disso, a transformação transitória em planta pode ser aplicada para muitas análises genômicas funcionais32. Estudos genômicos funcionais do cacau visam solucionar a suscetibilidade dessa espécie a diversos patógenos, como Moniliophthora perniciosa e Phytophthora spp33, aumentar sua resistência à seca34 e melhorar suas qualidades organolépticas35. Este protocolo tem o potencial de aprimorar e aprofundar os estudos genômicos funcionais do cacaueiro, uma vez que possibilita a transformação transitória em plantas de cacaueiros de grande porte ou mesmo em outras espécies vegetais de grande porte, recalcitrantes e perenes.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos a Lic. Jesús Fuentes González e Néstor Iván Robles Olivares pela ajuda na filmagem do vídeo. Agradecemos os generosos presentes da Dra. Antonia Gutierrez Mora do CIATEJ (Theobroma cacao plants). Agradecemos também ao CIATEJ e ao Laboratorio Nacional PlanTECC, México, pelo apoio às instalações. H.E.H.D. (CVU: 1135375) realizou estudos de mestrado com financiamento do Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). A R.U.L. agradece o apoio do Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) e da Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (Grant 7270-2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
| MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
| MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
| Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
| Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
References
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