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Biology

पुनर्गठित पौधों के प्लांटा परिवर्तन के लिए वैक्यूम-मजबूर एग्रोफिल्टरेन्स: एक केस स्टडी के रूप में कोको

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/66024
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Unidad de Biotecnología Vegetal, Centro de Investigación Y Asistencia en Tecnología Y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), 2Red de Estudios Moleculares Avanzados, Instituto de Ecología, 3Unidad de Biotecnología Industrial, Centro de Investigación Y Asistencia en Tecnología Y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ)

Summary

यहां, हम बड़े आकार के पौधों के आनुवंशिक परिवर्तन के विवो अध्ययन के लिए स्थानीयकृत वैक्यूम घुसपैठ के लिए पहला प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने पहली बार कोको के प्लांटा क्षणिक परिवर्तन में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता हासिल की।

Abstract

प्लांटा परिवर्तन में क्षणिक पौधे आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक तेज़ और लागत प्रभावी विकल्प है। प्लांटा परिवर्तन के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन के उपयोग पर निर्भर करते हैं। हालांकि, वर्तमान में उपयोग में आने वाले प्रोटोकॉल को वैक्यूम उपचार के लिए बड़े आकार के पौधों को जमा करने की भौतिक और आर्थिक बाधाओं के कारण छोटे आकार के पौधों के लिए मानकीकृत किया जाता है। यह काम बड़े आकार के पौधों के लिए अनुकूलित स्थानीयकृत वैक्यूम-आधारित एग्रोइनफिल्ट्रेशन के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रस्तावित विधि की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, हमने कोको पौधों में इसके उपयोग का परीक्षण किया, जो आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक उष्णकटिबंधीय पौधों की प्रजाति है। हमारे प्रोटोकॉल ने कोको के पत्तों के एक स्थानीय हवाई हिस्से में पुनरावृत्ति के साथ 0.07 एमपीए वैक्यूम तक लागू करने की अनुमति दी, जिससे संलग्न पत्तियों के अंतरकोशिकीय स्थानों में एग्रोबैक्टीरियम की घुसपैठ को मजबूर करना संभव हो गया। नतीजतन, हमने रूबी रिपोर्टर सिस्टम के लिए व्यक्त करने वाले संलग्न कोको पत्तियों के प्लांटा परिवर्तन में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता क्षणिक हासिल किया। यह कोको के प्लांटा क्षणिक परिवर्तन में पहला एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता भी है। यह प्रोटोकॉल समान आकार की बाधाओं के साथ अन्य पौधों की प्रजातियों के लिए वैक्यूम-आधारित एग्रोइनफिल्ट्रेशन विधि के आवेदन की अनुमति देगा और पुनर्गठित वुडी, बड़े आकार की प्रजातियों में जीन के प्लांटा लक्षण वर्णन के लिए दरवाजा खोलेगा।

Introduction

पादप आनुवंशिक परिवर्तन विधियां जीन के जैविक कार्यों के परीक्षण के लिए आवश्यक हैं और आज विशेष रूप से उपयोगी हैं, जो जीनोमिक युग1 के बाद की भविष्यवाणी की गई बड़ी संख्या में अनियंत्रित जीन हैं। इन विधियों का उपयोग पूरी तरह से रूपांतरित रेखाओं को प्राप्त करने या जीन को क्षणिक रूप से व्यक्त करने के लिए किया जा सकता है। स्थिर परिवर्तन तब होता है जब मेजबान द्वारा लिया गया विदेशी डीएनए पूरी तरह से और अपरिवर्तनीय रूप से मेजबान जीनोम में एकीकृत हो जाता है, और आनुवंशिक संशोधनों को बाद की पीढ़ियों तक पारित किया जाता है। क्षणिक अभिव्यक्ति, क्षणिक परिवर्तन के रूप में जाना जाता है, सेल में एग्रोबैक्टीरियम द्वारा स्थानांतरित टी-डीएनए की कई प्रतियों से होता है, जिन्हें मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं किया गया है,और संक्रमण 2-4 दिनों के बाद चोटियों 2.

यह क्षणिक अभिव्यक्ति assays अक्सर जीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए पर्याप्त हैं और स्थिर परिवर्तन पर कई लाभ की पेशकश कर सकते हैं कि ध्यान देने योग्य है. उदाहरण के लिए, क्षणिक परिवर्तन ऊतक संस्कृति आधारित उत्थान प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है. एक और लाभ यह है कि यह जीन के प्लांटा कार्यात्मक विश्लेषण के साथ संगत है, मॉडल पौधों की प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से मानकीकृत प्रोटोकॉल के मौजूदा कई सफल उदाहरण, जैसे कि अरबिडोप्सिस थालियाना3 और निकोटियाना बेंथमियाना4, लेकिन अभी भी गैर-मॉडल प्रजातियों में सीमितहै 5.

क्षणिक परख का विकास कुशल जीन स्थानांतरण विधियों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। इसके लिए, सबसे लोकप्रिय दृष्टिकोण एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ पर आधारित हैं, जो एग्रोबैक्टीरियम की अद्वितीय क्षमता का लाभ उठाता है ताकि डीएनए को पौधों की कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जासके। इन विश्लेषणों के लिए एक अन्य उपयोगी उपकरण रिपोर्टर जीन का उपयोग है, जैसे कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), β-ग्लुकुरोनिडेस (जीयूएस), लूसिफ़ेरेज़, या रूबी, जिनमें से सभी परिवर्तन की घटनाओं को ट्रैक करने के लिए नियोजित हैं। इन रिपोर्टर प्रणालियों में, रूबी वर्तमान में कल्पना करने में सबसे आसान है और तीन एंजाइमेटिक स्टेप प्रतिक्रियाओं के माध्यम से टायरोसिन के बीटालेन में रूपांतरण पर निर्भर करता है। अन्य रिपोर्टर प्रणालियों के विरोध के रूप में, परिणामी बीटालेन को परिष्कृत उपकरण या अतिरिक्त अभिकारकों की आवश्यकता के बिना रूपांतरित पौधे के ऊतकों पर चमकीले रंग के रंगद्रव्य के रूप में आसानी से देखा जा सकताहै।

पत्ती मेसोफिल के अंतरकोशिकीय स्थान में एक एग्रोबैक्टीरियम निलंबन में घुसपैठ करते समय, सफल एग्रोइन्फेक्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम पत्तियों के एपिडर्मल छल्ली द्वारा लगाए गए भौतिक अवरोध पर काबू पानाहै 8. जबकि कुछ पौधों के लिए, एक सुई कम सिरिंज (सिरिंज Agroinfiltration) के साथ बनाई गई एक दबाव ढाल एक कुशल कृषि घुसपैठ के लिए पर्याप्त है, के रूप में निकोटियाना बेंथमियाना9 में होता है, अन्य पौधों की प्रजातियों को एक बड़ा दबाव ढाल की आवश्यकता हो सकती है जैसे कि वैक्यूम पंप10 की मदद से बनाया गया। वैक्यूम-असिस्टेड प्रक्रियाओं में, एग्रोइनफिल्ट्रेशन दो चरणों में होता है। पहले एक में, वैक्यूम पौधे की सामग्री को कम दबाव के अधीन करने का कार्य करता है, जिससे रंध्र और घावों के माध्यम से मेसोफिल वायु रिक्त स्थान से गैसों की रिहाई होती है। फिर, एक दमन चरण के दौरान, Agrobacterium निलंबन रंध्र औरघावों 11 के माध्यम से अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान घुसपैठ.

सिरिंज घुसपैठ की तुलना में, वैक्यूम घुसपैठ उच्च उपयोग आवृत्ति, दोहराव, और घुसपैठ प्रक्रिया10 के हर चरण में दबाव और अवधि को नियंत्रित करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है. पालक (स्पिनैसिया ओलेरासिया)12, peony (एक वुडी बारहमासी) (Paeonia ostii)13, और लोबिया (Vigna unguiculata)14के रूप में विभिन्न पौधों की प्रजातियों की पत्तियों में, वैक्यूम agroinfiltration प्रोटोकॉल सिरिंज घुसपैठ की तुलना में एक गहरी घुसपैठ दर हासिल की. इसी तरह, टमाटर (लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम)15, और गेरबेरा (गेरबेरा हाइब्रिडा)16 में, वैक्यूम एग्रोफिल्ट्रेलेशन ने सिरिंज घुसपैठ की तुलना में मजबूत और अधिक समान जीन साइलेंसिंग का उत्पादन किया। वैक्यूम घुसपैठ का एक अतिरिक्त लाभ सिरिंज घुसपैठ की तुलना में जीनोटाइप पर कम निर्भरता है, जो हाल ही में तीन साइट्रस किस्मों (फॉर्च्यूनला ओबोवाटा, साइट्रस लिमोन, और सी। हालांकि, जब पौधों के लिए वैक्यूम एग्रोइनफिलेशन लागू करने की कोशिश की जाती है जो डेसिकेटर में फिट होने के लिए बहुत बड़े होते हैं, तो वैक्यूम कक्षों का आकार एक सीमा हो सकता है, जैसा कि आमतौर पर उष्णकटिबंधीय वुडी पौधों के साथ होता है।

नीचे, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो वैक्यूम कक्षों की स्थानिक सीमा पर काबू पाता है, कोको के पत्तों के प्लांटा क्षणिक परिवर्तन के लिए इसकी उपयोगिता का परीक्षण करता है। हम कोको के लिए पहली स्थानीयकृत वैक्यूम घुसपैठ विधि प्रस्तुत करते हैं, जिसमें अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और यहां तक कि पूरे संयंत्र की घुसपैठ के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही प्रयोगशाला desiccators के उपयोग की अनुमति देता है, लेकिन एक सरल अनुकूलन के साथ जो वैक्यूम कक्ष के अंदर पौधे के एक हिस्से तक पहुंच की अनुमति देता है, पौधे के विकास के विभिन्न चरणों में इसके उपयोग की अनुमति देता है। प्रस्तावित स्थानीयकृत वैक्यूम घुसपैठ विधि की उपयोगिता का परीक्षण करने के लिए, हमने कोको को एक बड़े-छिलके वाले उष्णकटिबंधीय पौधों की प्रजातियों के प्रॉक्सी के रूप में चुना जो बदलना मुश्किल है। इस स्थानीयकृत घुसपैठ विधि का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता वैक्यूम घुसपैठ द्वारा एवोकैडो में प्लांटा क्षणिक अभिव्यक्ति में पहली बार रिपोर्ट की, जो पहले अलग पत्तियों18 के लिए अनुकूलित थी, और यहां हम कोको में प्लांटा क्षणिक अभिव्यक्ति में पहली रिपोर्ट करते हैं।

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Protocol

1. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स संस्कृति

  1. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स की थॉ इलेक्ट्रोकोम्पेसिटेंट कोशिकाएं LBA4404 तनाव देती हैं।
  2. खमीर माल्ट के 1 एमएल जोड़ें (वाईएम; तालिका 1) एक 17 मिमी x 100 मिमी संस्कृति ट्यूब के लिए शोरबा। इस ट्यूब को बाद के लिए सेव करें, और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर रखें।
  3. 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में, पिघले हुए एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं के 30 माइक्रोन और डीएनए के 100-250 एनजी (5 माइक्रोन तक) 35 एस: रूबी जोड़ें। धीरे से मिलाएं।
    नोट: 35S: रूबी Yunde झाओ से एक उपहार था। नमूना आर्किंग से बचने के लिए, जितना संभव हो आयनिक यौगिकों की उपस्थिति को कम करें। ये आयनिक यौगिक डीएनए19 के इथेनॉल वर्षा से अवशिष्ट लवण हो सकते हैं।
  4. इस बिंदु पर, बर्फ पर एक 1 मिमी electroporation क्युवेट जगह है.
  5. पिछले निलंबन मिश्रण को ठंडा 1 मिमी इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें। सब कुछ बर्फ पर रखें। क्युवेट के धातु इलेक्ट्रोड पोंछ.
  6. इलेक्ट्रोपोरेटर को एजीआर (2.2 केवी, ~ 5 एमएस, 1 पल्स) पर सेट करें। इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष के अंदर क्युवेट रखें।
  7. पल्स बटन दबाएं। पल्स मापदंडों को पंजीकृत करें। यदि नमूना चाप हो जाता है, तो इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया विफल हो जाती है।
    नोट: नाड़ी के ठीक बाद कोशिकाओं को वाईएम शोरबा में जल्दी से स्थानांतरित करना महत्वपूर्ण है। इस हस्तांतरण में देरी नाटकीय रूप से परिवर्तन दक्षता20 को कम कर सकते हैं.
  8. तुरंत, कोशिकाओं को क्युवेट से 17 मिमी x 100 मिमी ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए सहेजे गए YM शोरबा का उपयोग करें। कोशिकाओं धीरे resuspend.
  9. एक कक्षीय इनक्यूबेटर पर 28 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर 3 घंटे के लिए रूपांतरित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस संस्कृति में एंटीबायोटिक्स नहीं हैं; उचित सड़न रोकनेवाला स्थितियों के बारे में सतर्क रहें।
  10. चयनात्मक YM अगर प्लेटों पर इस संस्कृति लकीर21. रूपांतरित LBA4404-रूबी तनाव के लिए, सुनिश्चित करें कि इन प्लेटों में रिफैम्पिसिन (25 μg/mL), स्पेक्टिनोमाइसिन (50 μg/mL), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 μg/mL) हैं। इस प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस खड़े इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, वेक्टर 35 एस: रूबी का उपयोग किया गया था, जो स्पेक्टिनोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए जीवाणु प्रतिरोध प्रदान करता है और घुसपैठ वाले पौधे के ऊतकों पर एक दृश्य रिपोर्टर के रूप में कार्य करता है।
  11. वाईएम शोरबा और लुरिया बर्टानी (एलबी) शोरबा (क्रमशः 9: 1 अनुपात में), एमईएस के 10 एमएम, पीएच 5.722 के मिश्रण के 12.5 एमएल पर रातोंरात संस्कृति से कालोनियों को टीका लगाएं। सुनिश्चित करें कि इस चयनात्मक तरल माध्यम में चरण 1.10 में उपयोग किए जाने वाले समान एंटीबायोटिक्स शामिल हैं। इन माध्यमों के लिए सामग्री और सांद्रता देखने के लिए तालिका 1 देखें।
    1. एग्रोबैक्टीरियम को इनक्यूबेट करते समय, कल्चर के लिए पर्याप्त वातन स्थान छोड़ दें, तरल मात्रा का लगभग 4 से 5 गुना। सेल क्लंपिंग से बचने के लिए एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन LBA4404 के लिए वाईएम शोरबा का उपयोग करें23.
  12. 28 डिग्री सेल्सियस कक्षीय इनक्यूबेटर पर 250 आरपीएम पर 16 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  13. चरण 1.11 में उपयोग किए जाने वाले समान माध्यम के साथ प्रारंभिक मात्रा के 10 गुना तक संस्कृति को स्केल करें।
  14. एक 28 डिग्री सेल्सियस कक्षीय इनक्यूबेटर पर 16 घंटे और 250 आरपीएम के लिए संस्कृति सेते हैं.
  15. रातोंरात संस्कृति को 0.4 के ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो600) में समायोजित करें। एसिटोसिरिंगोन (एएस) के 20 माइक्रोन जोड़ें।
  16. 28 डिग्री सेल्सियस कक्षीय इनक्यूबेटर पर 250 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें जब तक कि आयुध डिपो600 लगभग 1.0 तक नहीं पहुंच जाता।
  17. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 4 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
  18. निलंबन समाधान (10 एमएम एमईएस, 10 एमएम एमजीसीएल2, पीएच 5.7) के साथ गोली को फिर से निलंबित करें, ओडी600 को 0.6 समायोजित करें। 24 के रूप में 200 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: 28 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन समाधान को पूर्व-सेते हैं। यदि जोड़ा जाने पर निलंबन समाधान ठंडा है, तो कोशिकाएं अवक्षेपित हो जाएंगी।
  19. अंधेरे की स्थिति में 2-24 घंटे और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए जीवाणु निलंबन छोड़ दें। आंदोलन की आवश्यकता नहीं है22.

2. पौधे का चयन

  1. एग्रोइनफिल्ट्रेशन के लिए इष्टतम चरण में पत्तियों के साथ एक शाखा के साथ एक पौधा चुनें।
    नोट: पौधा पूर्ण विकसित या परिपक्व पेड़ हो सकता है। कोको के लिए, सी चरण की युवा पत्तियों की सिफारिश की जाती है। ये पत्ते कांस्य से हल्के हरे रंग के होते हैं; वे पूरी तरह से विस्तारित नहीं हैं और न ही चरण डी के रूप में कठोर25 (चित्रा 1) छोड़ देता है।
    1. एक नियंत्रण के रूप में, एक साथ अन्य पौधों (जैसे, निकोटियाना टैबैकम) पर एक उच्च एग्रोइनफिल्ट्रेशन दक्षता के साथ एग्रोइनफिल्ट्रेशन करें जो उपयोग किए गए तनाव और वेक्टर के लिए रिपोर्ट किया गया है।
      नोट: यदि इस नियंत्रण में कोई सकारात्मक परिणाम प्राप्त नहीं होते हैं, तो संभव है कि नकारात्मक परिणाम तनाव या उपयोग किए गए वेक्टर के कारण हों।

3. वैक्यूम कक्ष सेटअप

  1. एक वैक्यूम कक्ष के रूप में, एक desiccator का उपयोग करें जिसमें वैक्यूम दबाव को मापने के लिए वैक्यूम गेज होता है।
  2. चरण 1.19 से एग्रोबैक्टीरियम निलंबन में जैस्मोनिक एसिड (जेए)18,26 के 250 माइक्रोन जोड़ें।
  3. चयनित शाखा और पत्तियों को जलमग्न करने के लिए एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति को एक चौड़े मुंह वाले बीकर में स्थानांतरित करें। फिर, desiccator के अंदर Agrobacterium संस्कृति के साथ बीकर जगह है.
  4. शाखा को डेसिकेटर और उसके ढक्कन के बीच रखें। एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति के अंदर वांछित पत्तियों को जलमग्न करना सुनिश्चित करें। अगला, एक कूद अंगूठी का उपयोग करें, जो एक कटआउट के साथ एक गोल अंगूठी है जो पौधे की शाखा को desiccator में प्रवेश करने की अनुमति देता है। जंप रिंग डेसिकेटर के नीचे और ऊपर के बीच एक स्पेसर के रूप में भी काम करती है।
  5. सुनिश्चित करें कि गैसकेट संरचनात्मक रूप से पर्याप्त स्थिर है ताकि ढक्कन के साथ निचोड़ा जा सके, झुकने और desiccator की परिधि में समायोजित करने के लिए पर्याप्त लचीला हो, और झरझरा सामग्री से बना न हो।
    नोट: इस अध्ययन में एक फंसे हुए धातु के तार का उपयोग किया गया जिसमें कई छोटे तारों को एक साथ घुमाया गया, जो एक गैसकेट (चित्रा 2) जैसा दिखने वाला एक गैर-छिद्रपूर्ण प्लास्टिक सामग्री के साथ लेपित था।
  6. शाखा को डेसिकेटर पर ठीक करने के लिए, सिलिकॉन इंप्रेशन सामग्री का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि सामग्री चिपचिपी, गैर-छिद्रपूर्ण, रासायनिक रूप से डेसिकेटर और पौधे के लिए निष्क्रिय है, और शाखा, गैसकेट और डेसिकेटर के बीच छोटे अंतराल को लागू करना और भरना आसान है।
  7. एक बार सिलिकॉन इंप्रेशन सामग्री पोलीमराइज़ हो जाती है (इसमें लगभग 1 मिनट लगते हैं) और शाखा को जगह में ठीक कर देता है, डेसिकेटर को बंद कर देता है। सुनिश्चित करें कि कोई अंतराल न छोड़ें।
  8. desiccator को वैक्यूम पंप से कनेक्ट करें (चित्र 3)।

4. वैक्यूम घुसपैठ

  1. वैक्यूम पंप शुरू करें जब तक कि यह -0.07 एमपीए तक न पहुंच जाए।
  2. एक बार जब यह इस दबाव तक पहुंच जाता है, तो दबाव वाल्व बंद कर दें और वैक्यूम पंप बंद कर दें। 5 मिनट के लिए इस दबाव को बनाए रखें.
  3. चैम्बर दबाव बहाल करने के लिए दबाव वाल्व खोलें.
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। चैम्बर दबाव धीरे-धीरे और तेजी से बहाल. यह पूरी तरह से desiccator repressurize करने के लिए 3 मिनट तक लग सकते हैं. विस्तारित पुन: दबाव ऊतक10 के अंदर घुसपैठ बैक्टीरिया की संख्या बढ़ जाती है.
  4. इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
  5. सेल निलंबन और desiccator से शाखा ले लो.
  6. घुसपैठ की पत्तियों को आसुत जल से साफ करें।

5. घुसपैठ की पत्तियों का इनक्यूबेशन

  1. घुसपैठ पत्तियों 48 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे की स्थिति में रहने दें.
  2. फिर, घुसपैठ ऊतक को 16/8-घंटे प्रकाश/अंधेरे फोटोपेरियोड में उजागर करें।
  3. संक्रमण (डीपीआई) के 3-7 दिनों के बाद क्षणिक पत्ती परिवर्तन का मूल्यांकन करें।

Figure 1
चित्र 1: कोको विकासात्मक चरणों को छोड़ देता है। (ए-ई) विकासात्मक चरण25. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वैक्यूम कक्ष विन्यास और इसके घटक। वैक्यूम चैंबर एक वैक्यूम गेज से जुड़ा एक desiccator है। गैसकेट/ओ-रिंग को काट दिया जाता है, इसलिए इसमें एक उद्घाटन होता है जहां शाखा रखी जाएगी। (ए) वैक्यूम गेज, (बी) ढक्कन, (सी) गैसकेट / ओ-रिंग, (डी) दबाव वाल्व, (ई) डेसिकेटर, (एफ) नली। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्लांटा वैक्यूम एग्रोइनफिल्ट्रेशन सिस्टम में। घुसपैठ प्रक्रिया के दौरान वैक्यूम नुकसान से बचने के लिए, सिलिकॉन इंप्रेशन सामग्री के साथ शाखा को desiccator और गैसकेट / (ए) कोको संयंत्र, (बी) वैक्यूम चैंबर, (सी) सिलिकॉन छाप सामग्री, (डी) एग्रोबैक्टीरियम निलंबन पर डूबे हुए पत्ते, (ई) वैक्यूम पंप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल बड़े आकार के वुडी पौधों के लिए एक प्रभावी एग्रोइनफिरेशन विधि प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम -0.07 एमपीए के वैक्यूम दबाव को प्राप्त करने में सक्षम थे, जिसके परिणामस्वरूप कोको के पत्तों की प्रभावी, स्थानीयकृत घुसपैठ हुई। चित्रा 4 में, हम घुसपैठ प्रणाली की स्थापना प्रक्रिया का निरीक्षण करते हैं, और चित्रा 5 में, अंतिम विन्यास।

Figure 4
चित्रा 4: वैक्यूम कक्ष सेटअप। (ए) गैसकेट के दो सिरों के बीच शाखा प्लेसमेंट पर ध्यान दें। यह गैसकेट काफी बड़ा है जो शाखा को desiccator और उसके ढक्कन के बीच से गुजरने की अनुमति देता है। ध्यान दें कि शाखा की अनियमित सतह के कारण अंतराल बनते हैं। (बी) शाखा desiccator पर तय की गई है, और गठित अंतराल सिलिकॉन छाप सामग्री से भरे हुए हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: वैक्यूम घुसपैठ प्रणाली सेटअप। प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक बड़े आकार कोको संयंत्र के लिए वैक्यूम घुसपैठ प्रणाली के लिए सेटअप का उदाहरण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एग्रोइनफिल्ट्रेशन के पहले चरण के दौरान, ऊतक को कम दबाव के अधीन किया जाता है, जिससे गैसों को स्टोमेटा गुहाओं और आसन्न मेसोफिल वायु स्थानों से रंध्र के माध्यम से और घावों के माध्यम से छोड़ा जाता है। एग्रोबैक्टीरियम सस्पेंशन में डूबी पत्तियों की सतह पर छोटे बुलबुले वैक्यूम बढ़ने पर नग्न आंखों से देखे जा सकते हैं। अगला कदम ऊतकों को दबाना और हवा11 द्वारा छोड़े गए शून्य को भरने के लिए अंदर एग्रोबैक्टीरियम निलंबन को मजबूर करना है। घुसपैठ पत्तियों (चित्रा 6) कुछ क्षेत्रों में रंग में गहरे दिखाई देते हैं. यह इंगित करता है कि एग्रोबैक्टीरियम निलंबन ऊतक में प्रवेश कर गया है और पूरे फैल गया है, पत्ती8 के अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान को भरता है।

Figure 6
चित्रा 6: वैक्यूम एग्रोइनफिल्ट्रेशन के पूरा होने के बाद वयस्क कोको पत्तियों का अबाक्सियल दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस प्रोटोकॉल ने बड़े आकार के कोको पौधों की स्थानीय पत्तियों पर एग्रोइनफिल्ट्रेशन हासिल किया। ऐसा करके, हमने क्षणिक रूप से बड़े कोको पौधों को 35S: RUBY को एक रिपोर्टर सिस्टम के रूप में ले जाने वाले वेक्टर के साथ बदल दिया। हमने इस रिपोर्टर प्रणाली को कोको में सफल क्षणिक परिवर्तन का एक उपयोगी संकेतक पाया क्योंकि पत्तियों में बीटालेन का संचय परिवर्तन की दक्षता को इंगित करता है। Betalains चमकदार लाल रंगद्रव्य हैं, हरी पत्तियों पर एक अचूक संकेत का उत्पादन है कि नग्न आंखों (चित्रा 7) के साथ देखा जा सकता है. चूंकि पत्तियां पौधे से जुड़ी होती हैं, इसलिए बीटालेन जमा हो सकते हैं यदि घुसपैठ ऊतक अपनी व्यवहार्यता बनाए रखता है। चित्रा 8 परिणामों की एक श्रृंखला दिखाता है, जो चरण सी के रूपांतरित कोको पत्तियों पर उच्च से कम बीटालेन संचय से भिन्न होता है। यह उल्लेखनीय है कि इस प्रजाति पर रिपोर्ट किए गए प्लांटा क्षणिक परिवर्तन में यह पहला है।

Figure 7
चित्र 7: कोको क्षणिक रूप से 35S को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए बदल जाता है: रूबी। बीटालेन संचय के परिणामस्वरूप कोको के पत्तों पर लाल धब्बे प्लांटा में स्थानीयकृत वैक्यूम-आधारित एग्रोफिल्ट्रेलेशन के प्रस्तावित प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने का एक सरल और त्वरित तरीका है। 6 डीपीआई पर छवि, स्केल बार: 1 सेमी, ऑप्टिकल ज़ूम: 8x। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: कोको के पत्तों पर बीटालेन का संचय। रूबी रिपोर्टर के साथ एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता क्षणिक परिवर्तन द्वारा 6 डीपीआई पर कोको के पत्तों पर बीटालेन संचय के विभिन्न स्तर और पैटर्न। स्केल बार: 1 सेमी, ऑप्टिकल ज़ूम: 8x। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एलबी मध्यम YM मध्यम
खमीर निकालने 5 ग्राम/ली 0.4 ग्राम/ली
कैसिइन से ट्रिप्टोन एंजाइमैटिक डाइजेस्ट 10 ग्राम/ली
एनएसीएल 5 ग्राम/ली 0.1 ग्राम/ली
मैनिटोल 10 ग्राम/ली
एमजीएसओ4·7h20 0.204 ग्राम/ली
कश्मीर2एचपीओ4 0.38 ग्राम/ली
एमईएस 1.95 ग्राम/ली (10 मिमी) 1.95 ग्राम/ली (10 मिमी)
एमजीसीएल2

तालिका 1: वाईएम और एलबी माध्यमों की संरचना।

अनुपूरक चित्रा 1: एक सुई कम सिरिंज का उपयोग कर कोको पत्तियों पर मजबूर कृषि घुसपैठ की प्रतिनिधि छवि। सिरिंज घुसपैठ नग्न आंखों को दिखाई देने वाली पत्तियों में रूबी अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप नहीं हुई, लेकिन उस बिंदु पर नुकसान हुआ जहां सुई रहित सिरिंज के साथ दबाव लागू किया गया था। 6 डीपीआई पर छवि, स्केल बार: 5 मिमी, ऑप्टिकल ज़ूम: 25x। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस काम में, हमने एक उदाहरण के रूप में कोको पौधों का उपयोग करते हुए, लकड़ी के पौधों के प्लांटा क्षणिक परिवर्तन के लिए एक कुशल, कम लागत वाला एग्रोइनफिल्ट्रेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया। पौधों के ऊतकों के परिवर्तन के लिए पत्तियों की छल्ली का प्रतिनिधित्व करने वाली प्रसिद्ध बाधा को देखते हुए, हमने लकड़ी के पौधों में वैक्यूम द्वारा एग्रोइनफिल्ट्रेशन की सुविधा के लिए एक रणनीति विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया, जो आमतौर पर इस प्रक्रिया के लिए अड़ियल होते हैं।

वैक्यूम कक्ष के अंदर प्राप्त वैक्यूम दबाव केवल कुशल सीलिंग और desiccator, पेड़ की शाखा, गैसकेट / ओ-रिंग, और desiccator के ढक्कन के बीच बनाई गई छोटे अंतराल को भरने के कारण संभव था, जो प्रोटोकॉल की मुख्य चुनौती थी। इस कारण से, शाखा को desiccator पर ठीक करने के लिए सिलिकॉन इंप्रेशन सामग्री का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यह सामग्री गैर-छिद्रपूर्ण है, शाखा को डेसिकेटर और गैसकेट का पालन करने के लिए पर्याप्त चिपचिपा साबित होती है, और रासायनिक रूप से निष्क्रिय होती है, इसलिए न तो घुसपैठ की गई शाखा और न ही डेसिकेटर क्षतिग्रस्त होता है।

इसके अलावा, यह पत्ती अनुभाग के अंदर एक दबाव ढाल प्राप्त करने के लिए एक वैक्यूम पंप का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, जिससे हवा को स्टोमेटा गुहा और मेसोफिल क्षेत्रों से चूसा जा सकता है, फिर दमन के दौरान एक बड़ा दबाव ढाल एग्रोबैक्टीरियम निलंबन को रंध्र और घावों के माध्यम से पत्ती में धकेलताहै 10. हमने वैक्यूम पंप के रूप में फ्रीज ड्रायर का इस्तेमाल किया। यह बहुमुखी प्रतिभा और हर प्रयोगशाला की जरूरतों के लिए इस प्रोटोकॉल की अनुकूलनशीलता का एक उदाहरण है. वैक्यूम पंप के रूप में फ्रीज ड्रायर का उपयोग करके, -0.07 एमपीए तक पहुंचने में लगभग 3 मिनट लग गए। यह कोको के लिए प्रभावी है क्योंकि पिछले लेखकों ने भी एक ही वैक्यूम दबाव25 के साथ कोको अलग पत्तियों में घुसपैठ की है। यह पसंदीदा घुसपैठ विधि है क्योंकि यह गैर-सहायता प्राप्त या सुई रहित सिरिंज घुसपैठ(पूरक चित्रा 1)की तुलना में अधिक दोहराने योग्य है। वैक्यूम घुसपैठ के लिए वैक्यूम पंप का उपयोग करते समय, उपयोगकर्ता दबाव और समय को नियंत्रित कर सकता है कि ऊतक वैक्यूम10 के संपर्क में आते हैं।

चिनार जैसे अन्य पौधों में, यह अध्ययन किया गया है कि पत्ती की संरचना मध्योतक कोशिकाओं की व्यवस्था के कारण घुसपैठ दक्षता को प्रभावित कर सकती है। इन कोशिकाओं के विभिन्न और चर व्यवस्था एग्रोबैक्टीरियम निलंबन 8,27 द्वारा एक असमान घुसपैठ में परिणाम हो सकता है क्योंकि पत्ती की आंतरिक संरचना में अंतरकोशिकीय वायु अंतराल8 है। यद्यपि पत्तियों के रंध्र के माध्यम से सहज घुसपैठ तब हो सकती है जब पत्तियों को एग्रोबैक्टीरियम निलंबन में डुबोया जाता है, वायुमंडलीय दबाव एपिडर्मल छल्ली को दूर करने और बैक्टीरिया निलंबन के साथ इन वायु स्थानों को विस्थापित करने के लिए पर्याप्त प्रभावी नहीं होता है; यह इस तरह के Persea americana18 के रूप में अन्य recalcirantent प्रजातियों के साथ कोशिश की गई है. इस कारण के लिए, मजबूर वैक्यूम मध्यस्थता agroinfiltration रंध्र याघावों 10 के माध्यम से पत्तियों में पदार्थ प्रवेश की सुविधा के लिए एक कुशल तरीका साबित होता है. बायोलिस्टिक इनोक्यूलेशन और एग्रोइनोक्यूलेशन द्वारा बदनावायरस कोको सूजी हुई शूटिंग घाना एम वायरस संक्रामक क्लोन के साथ युवा कोको रोपे का टीकाकरण हाल ही में28 रिपोर्ट किया गया है। कोको में, सबसे क्षणिक परिवर्तन assays अलग पत्तियों25,29 पर प्रदर्शन कर रहे हैं, संयंत्र सामग्री गिरावट के कारण कम क्षणिक अभिव्यक्ति रखरखाव में जिसके परिणामस्वरूप. हमारे ज्ञान के लिए, कोको पौधों पर प्लांटा क्षणिक आनुवंशिक परिवर्तन की कोई रिपोर्ट नहीं है। यहां, हमने कोको का पहला क्षणिक परिवर्तन हासिल किया, और पहले, हमारे एक ही अध्ययन समूह ने पर्सिया अमेरिकाना18 में इसे हासिल किया, जिससे यह चयापचयों या अणुओं के विवो विश्लेषण में स्थानीयकृत संभव के लिए एक व्यवहार्य पद्धति बन गया जो केवल पत्तियों पर व्यक्त किए जाते हैं।

35S के साथ क्षणिक परिवर्तन : रूबी वेक्टर की पुष्टि कोको के पत्तों पर बीटालेन की क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा की गई थी। यह वेक्टर पौधों पर बीटालेन बायोसिंथेटिक मार्ग का पुनर्गठन करता है जो स्वाभाविक रूप से इन पिगमेंट का उत्पादन नहीं करते हैं। केवल कुछ Caryophyllales स्वाभाविक रूप से अपने स्वयं के चयापचय रास्ते30 के साथ tyrosine से betalains biosynthesize कर सकते हैं. इस चयापचय को दोहराने के लिए, 35S: रूबी में तीन एंजाइमों की विषम अभिव्यक्ति के लिए आनुवंशिक जानकारी होती है जो आमतौर पर मौजूद अमीनो एसिड टायरोसिन को बीटालेन7 में परिवर्तित करती है।

प्लांटा क्षणिक परिवर्तन प्रोटोकॉल में स्थिर परिवर्तन प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं, जिनमें तेज, लागत प्रभावी और बढ़ी हुई परिवर्तन दक्षता31 शामिल है। इसके अलावा, प्लांटा क्षणिक परिवर्तन में कई कार्यात्मक जीनोमिक्स विश्लेषण32 के लिए लागू किया जा सकता है। कोको पर कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन इस प्रजाति की रोग संवेदनशीलता को कई रोगजनकों को हल करना है, जैसे कि मोनिलियोफ्थोरा पर्निसियोसा और फाइटोफ्थोरा एसपीपी33, उनके सूखा प्रतिरोध34 को बढ़ाते हैं, और इसके ऑर्गेनोलेप्टिक गुणों में सुधार करते हैं35. इस प्रोटोकॉल में कोको कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययनों को बेहतर बनाने और गहरा करने की क्षमता है क्योंकि यह बड़े आकार के कोको के पेड़ों पर या यहां तक कि अन्य बड़े पुनर्गणना और बारहमासी पौधों की प्रजातियों में प्लांटा क्षणिक परिवर्तन को संभव बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम एलआईसी को धन्यवाद देते हैं। वीडियो फुटेज फिल्माने में उनकी सहायता के लिए जेसुस फ्यूएंटेस गोंजालेज और नेस्टर इवान रॉबल्स ओलिवारेस हैं। हम CIATEJ (थियोब्रोमा कोको पौधों) के डॉ. एंटोनिया गुटिरेज़ मोरा द्वारा उदार उपहारों को स्वीकार करते हैं। हम सुविधा सहायता के लिए CIATEJ और Laboratorio Nacional PlanTECC, मेक्सिको को भी धन्यवाद देते हैं। H.E.H.D. (CVU: 1135375) ने Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT) से वित्त पोषण के साथ मास्टर अध्ययन किया। R.U.L. Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL), और Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), जलिस्को, मेक्सिको (ग्रांट 7270-2018) से समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35S:RUBY plasmid Addgene 160908 http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette Thermo Fisher Scientific  FB101 Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator Bel-Art SP SCIENCEWARWE F42400-2121
Freeze dryer LABCONCO 700402040
K2HPO4 Sigma Aldrich P8281-500G For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium Intact Genomics USA 1285-12 https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol Sigma Aldrich 63560-250G-F For YM medium add 10 g/L
MES Sigma Aldrich PHG0003 (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20 Sigma Aldrich 63138-1KG For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus Biorad  165-2100
NaCl Karal 60552 For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific  13-400-518
President Silicone Impression material COLTENE 60019938
Rifampicin  Gold-Bio R-120-1 (100 mg/mL)
Silicone Impression material gun Andent TBT06
Spectinomycin Gold-Bio S-140-SL10 (100 mg/mL)
Streptomycin Gold-Bio S-150-SL10 (100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein Sigma Aldrich 95039-1KG-F For LB medium add 10 g/L
Yeast extract MCD LAB 9031 For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L

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References

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जीवविज्ञान अंक 201
पुनर्गठित पौधों के <em>प्लांटा परिवर्तन के</em> लिए वैक्यूम-मजबूर एग्रोफिल्टरेन्स: एक केस स्टडी के रूप में कोको
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Hernández-Delgado, H. E.,… More

Hernández-Delgado, H. E., Zamora-Briseño, J. A., Figueroa-Yáñez, L. J., Urrea-López, R. Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study. J. Vis. Exp. (201), e66024, doi:10.3791/66024 (2023).

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