Модель ex vivo перитонеального метастазирования рака яичников с использованием сальника человека
Summary
Этот протокол описывает создание трехмерной (3D) ex vivo модели взаимодействия раковых клеток и сальника. Модель обеспечивает платформу для выяснения проопухолевых механизмов в жировой нише и для тестирования новых методов лечения.
Abstract
Рак яичников является самым смертоносным гинекологическим злокачественным новообразованием. Сальник играет ключевую роль в обеспечении поддерживающего микроокружения для метастатических раковых клеток яичников, а также иммуномодулирующих сигналов, которые обеспечивают устойчивость опухоли. Тем не менее, у нас есть ограниченные модели, которые точно имитируют взаимодействие между клетками рака яичников и тканями, богатыми жировыми отложениями. Для более глубокого понимания клеточных и молекулярных механизмов, с помощью которых сальник обеспечивает проопухолевое микроокружение, мы разработали уникальную 3D-модель взаимодействия раковых клеток и сальников ex vivo . Используя сальник человека, мы можем выращивать раковые клетки яичников в этой богатой жиром микросреде и контролировать факторы, ответственные за рост опухоли и иммунную регуляцию. В дополнение к предоставлению платформы для изучения этого богатого жировой тканью опухолевого микроокружения, модель обеспечивает отличную платформу для разработки и оценки новых терапевтических подходов к воздействию на метастатические раковые клетки в этой нише. Предложенная модель проста в создании, недорога и применима к трансляционным исследованиям.
Introduction
Рак яичников является самым смертоносным гинекологическим злокачественным новообразованием во всем мире1. Риск развития этого вида рака в течение жизни составляет примерно 1 к 70, а средний возраст постановки диагноза составляет63 года. Первичные злокачественные опухоли яичников гистологически классифицируются как эпителиальные или неэпителиальные. Эпителиальный рак яичников (ЭОК) составляет более 90% опухолей, а наиболее распространенным подтипом является серозная карцинома высокой степени злокачественности (HGSC), на долю которой приходится примерно 70%-80% ЭОК. В настоящее время не существует эффективных методов скрининга для раннего выявления заболевания. Таким образом, большинству пациентов диагноз ставится на поздней стадии (т.е. на III или IV стадии Международной федерации гинекологии и акушерства (FIGO) после того, как рак распространился по всей брюшной полости.
Стандартным лечением первой линии является циторедуктивная операция по удалению всех видимых макроскопических заболеваний с последующей адъювантной химиотерапией на основе платины для уничтожения любого остаточного микроскопического заболевания. Несмотря на то, что за последние два десятилетия в лечении рака яичников было достигнуто много успехов, примерно у 70% пациенток с прогрессирующим заболеванием в течение 3лет после начала лечения наступает рецидив. Учитывая общий неблагоприятный прогноз для этих пациентов, текущие и будущие трансляционные исследования в EOC направлены на выявление биомаркеров для раннего выявления, предотвращения метастазирования, совершенствования существующих методов лечения для уклонения от резистентности и разработки новых персонализированных методов лечения рака.
Генерализованное метастазирование в брюшной полости и связанная с ним химиорезистентность являются двумя основными ограничениями для улучшения лечения пациенток с раком яичников 4,5. Сальник, жировая структура, похожая на фартук, которая свисает с желудка над кишечником, является основным местом метастазирования рака яичников 6,7. Было показано, что в дополнение к своей функции физического барьера сальник обладает регенеративными и ангиогенными способностями и обладает иммунной активностью, которая в совокупности способствует васкуляризации, ускоряет заживление ран и ограничивает инфекцию8. Он содержит высокую концентрацию стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток и могут помочь восстановить поврежденные ткани. Сальник может воспаляться в ответ на травму или инфекцию, что вызывает миграцию иммунных клеток к месту повреждения9. Эти иммунные клетки высвобождают факторы роста и другие молекулы, которые способствуют восстановлению и регенерации поврежденных тканей. Иммунные клетки, такие как макрофаги, лимфоциты и плазматические клетки, локализующиеся в сальнике, представляют собой структуры, известные как «млечные пятна», которые отвечают за обнаружение и атаку патогенов и регулирование перитонеального иммунитета. Также было показано, что сальник играет роль в индуцировании иммунной толерантности10, которая представляет собой способность иммунной системы переносить аутоантигены и не атаковать здоровые ткани. Тем не менее, та же самая иммунная активность также участвует в патологических реакциях, таких как рост опухолей яичников, метастазирование и ускользание от иммунного надзора 9,11. Предыдущие исследования, проведенные в нашей лаборатории и других лабораториях, продемонстрировали уникальную и активную роль микроокружения жировой ткани в ингибировании противоопухолевых иммунных реакций и в приобретении химиорезистентности12,13,14. К сожалению, мы располагаем ограниченной информацией о клеточных и молекулярных механизмах, с помощью которых сальник обеспечивает проопухолевое микроокружение.
Чтобы лучше понять взаимодействие между раковыми клетками и сальником, была разработана 3D-система культивирования, состоящая из клеток рака яичников человека и эксплантов сальника, полученных от пациентов. Протокол, описанный здесь, представляет собой новую модель перитонеального карциноматоза ex vivo . Эта модель имитирует естественное развитие онкогенеза рака яичников в этой богатой жировой тканью ткани. Предложенная модель проста в создании, недорога и потенциально применима для трансляционных исследований рака яичников.
Protocol
Representative Results
Discussion
С использованием этого протокола была разработана доклиническая модель перитонеального канцероматоса при раке яичников с использованием комбинации основных методов in vitro и ex vivo. Прогрессирующий рост опухоли наблюдался в течение 50 дней совместного культивирования после пос…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование частично финансируется Мемориальным фондом Джанет Беррос. Выражаем признательность пациентам и отделению гинекологической онкологии Института рака Карманоса за сбор образцов сальника. Мы также выражаем признательность Биобанку и Центру коррелятивных наук в Институте рака Карманоса за координацию набора пациентов и подготовку препаратов для выявления патологий. Биобанк и Центр корреляционных наук частично поддерживаются грантом P30 CA22453 Центра NIH Институту рака Карманоса при Государственном университете Уэйна.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Insulin Syringe with 26 G detachable needle | BD | 329652 | |
| 10 mL Serological Pipets | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 Well Cell Culture Plate | Costar | 3524 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L Sodium Bicarbonate | Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| No. 10 Stainless Steel Disposable Scalpel | Integra-Miltex | 4410 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Revolve microscope | Echo |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update. Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).
- Ledermann, J. A., et al. Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).
- Morgan, R. J., et al. Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Di Nicola, V. Omentum a powerful biological source in regenerative surgery. Regen Ther. 11, 182-191 (2019).
- Meza-Perez, S., Randall, T. D. Immunological functions of the omentum. Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).
- Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum. J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).
- Lee, W., et al. Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum. J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).
- Cardenas, C., et al. Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells. Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).
- Wu, Q., et al. Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression. J Hematol Oncol. 12 (1), 95 (2019).
- Zhang, Z., Scherer, P. E. Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte – a cancer cell’s best friend. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).
- Alvero, A. B., et al. TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo. Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).
- Alvero, A. B., et al. Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model. Sci Rep. 7, 40989 (2017).
- Craveiro, V., et al. Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment. Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).
- Sumi, N. J., et al. Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence. J Vis Exp. (93), e51815 (2014).
- Agarwal, R., et al. Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).
- Kelly, M. G., et al. TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer. Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).
- Li, J., et al. CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential. Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).
- Tedja, R., et al. Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential. Cancers (Basel). 15 (3), 15030684 (2023).
- Dauleh, S., et al. Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum. PLoS One. 11 (7), e0158997 (2016).
