Summary
כאן, אנו מבססים מודל חולדה של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות כדי לספק בסיס לחקר עין יבשה חסרת מים.
Abstract
עין יבשה חסרת מים (ADDE) היא סוג של מחלת עין יבשה שיכולה לגרום לירידה בכמות ואיכות הפרשת הדמעות. ייצור דמעות חריג ממושך עלול להוביל להפרעה בסביבת פני השטח של העין, כולל נזק לקרנית ודלקת. במקרים חמורים, ADDE יכול לגרום לאובדן ראייה או אפילו עיוורון. נכון לעכשיו, טיפול בעין יבשה מוגבל לטיפות עיניים או פיזיותרפיה, אשר יכולים רק להקל על תסמיני אי נוחות בעין ולא יכולים לרפא באופן יסודי תסמונת העין היבשה. כדי לשחזר את תפקוד בלוטת הדמעות בעין יבשה, יצרנו מודל חייתי של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות בחולדות המושרה על ידי סקופולמין. באמצעות הערכה מקיפה של בלוטת הדמעות, הקרניות, הלחמית וגורמים אחרים, אנו שואפים לספק הבנה מלאה של השינויים הפתולוגיים של ADDE. בהשוואה למודל עכבר העין היבשה הנוכחי, מודל זה של בעלי חיים ADDE כולל הערכה תפקודית של בלוטת הדמעות, ומספק פלטפורמה טובה יותר לחקר תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות ב- ADDE.
Introduction
עד שנת 2021, כ -12% מהאנשים מושפעים באופן משמעותי מיובשבעיניים 1, מה שהופך אותה לאחת ממחלות העיניים הכרוניות הנפוצות ביותר. ניתן לחלק את העין היבשה לשני סוגים: עין יבשה חסרת מים (ADDE) ועין יבשה באידוי (EDE)2, בהתאם לגורמים השונים המשפיעים על המחלה. ADDE מחולק גם לתסמונת סיוגרן (SS) ולא SS, אך רוב חולי העין היבשה הם חולים שאינם SS בקליני3. תסמיני עין יבשה כרוניים משפיעים באופן חמור על איכות הראייה של החולים. נכון לעכשיו, הטיפול הקונבנציונלי של DED כרוך ביישום של דמעות מלאכותיות כדי לשמן את פני העין ופיזיותרפיה של העפעפיים. עם זאת, תסמונת העין היבשה לא יכול להציע תרופה מלאה במקרים רבים. לכן, חקר הפתוגנזה של מחלת העין היבשה הוא חיוני לפיתוח טיפולים ותרופות חדשות. מודלים של בעלי חיים של תסמונת העין היבשה מספקים בסיס למחקר נוסף.
ישנן דרכים רבות לבנות מודלים של בעלי חיים של תסמונת העין היבשה4, כולל שינוי רמות הפרשת הדמעות על ידי שינוי רמות ההורמונים. לדוגמה, הסרת האשכים של חולדות יכולה להפחית את הפרשת אנדרוגן, להגביר את הפרשת הדמעות, ולהפחית את הריכוז של רכיב הפרשה חופשית (SC) ו- IgA בדמעות 5,6. שיטה נוספת היא להצביע על תגובות אוטואימוניות בבלוטת הדמעות על ידי הסרת עצבי פני העין השולטים על הבלוטה. בנוסף, ניתן להשיג הפחתה ישירה של הפרשת הדמעות על ידי הסרה כירורגית של בלוטת הדמעות7. תנאי סביבה משתנים יכולים גם להאיץ את אידוי הדמעות. לדוגמה, גידול בעלי חיים בתנאי לחות נמוכה ואוורור יבש יכול לבסס מודל של עין יבשה באידוי מוגזם8, אשר ניתן לשלב עם שיטות אחרות כדי להגביר את חומרת העין היבשה. התרופות העיקריות המשמשות להשראת מודלים ניסיוניים של עין יבשה הן אטרופין וסקופולאמין9. כמעכבים פאראסימפתטיים, שניהם יכולים לגרום לחסימה פרמקולוגית של קולטנים כולינרגיים (מוסקריניים) בבלוטת הדמעות ולעכב הפרשת דמעות. בהשוואה ליובש בעיניים הנגרם על ידי הזרקת שריר אטרופין10, לסקופולמין יש השפעה מעכבת חזקה יותר על בלוטות ההפרשה, משך זמן ארוך יותר של פעילות תרופתית, והשפעות חלשות יותר על שרירי הלב, המעי הדק והסימפונות. זוהי אחת התרופות הבשלות ביותר עבור מודלים של בעלי חיים עם עיניים יבשות.
ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי לגרום לעין יבשה עם סקופולמין, כגון הזרקה תת עורית, משאבת סמים, או יישום תיקון 4,11,12. על מנת להפחית את תדירות מתן התרופות לחיות ניסוי, חוקרים רבים מדביקים טלאים טרנסדרמליים על זנבות עכברים או משתמשים במשאבות סמים. עם זאת, לשתי השיטות הללו יש מגבלות. לדוגמה, ספיגת טלאים עוריים צריכה לקחת בחשבון את הקליטה האישית של עכברים, מה שעלול להוביל למינון תרופות לא עקבי. למרות משאבות סמים יכול לשלוט במדויק על המינון של כל ממשל, הם לא תמיד תואמים את התרופה מועברת או את הריכוז בשימוש. כמו כן, יש למקם אותם בניתוח – שהוא פולשני יותר לבעל החיים, הדורש אירוע הרדמה, וקיים פוטנציאל לסיבוכים לאחר הניתוח כגון הלחשה. הזרקה תת עורית, אם כי מסורבלת יותר, יכולה להבטיח מינון מדויק לכל מתן ולשמור על עקביות במתן התרופה בקרב חולדות שונות. יחד עם זאת, יש לו עלות נמוכה יותר והוא מתאים לביצוע מספר רב של ניסויים בבעלי חיים.
מחקר זה מיישם הזרקות תת עוריות חוזרות ונשנות של סקופולמין כדי לבסס מודל של חולדת עין יבשה. אנו מנתחים אינדיקטורים לעין יבשה כגון פגמים בקרנית, רמות הפרשת דמעות ומורפולוגיה פתולוגית של הקרנית, הלחמית ובלוטת הדמעות. על ידי שילוב של ריכוז תרופות, ביטויים פתולוגיים ותסמיני עין יבשה, אנו מרחיבים עוד יותר את מודל חולדת העין היבשה בפירוט, ומספקים נתונים ניסיוניים מדויקים יותר לחקר הטיפול בעין יבשה ומנגנונים פתולוגיים. אנו גם מתארים בפירוט את תהליך המידול עבור חוקרים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים בהתאם לפרוטוקול זה מבוצעים באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
1. הכנת בעלי חיים
- הכינו 12 נקבות ויסטאר בריאות בנות 6 שבועות עם מקדם הגנה במשקל 160 גרם ±-20 גרם.
- השתמש במנורת סדק ואופטלמוסקופ כדי לבחון את תנאי העיניים של כל החולדות, וודא שאין מקטע קדמי או מחלות רשתית.
- לגדל את כל החולדות במשך שבוע אחד עם מקורות מזון ומים מספיקים.
- חולקו באופן אקראי כל החולדות לקבוצות נורמליות, ריכוז תרופת סקופולמין 2.5 מ"ג/מ"ל, ריכוז תרופת סקופולאמין 5 מ"ג/מ"ל וריכוז תרופת סקופולאמין 7.5 מ"ג/מ"ל, עם שלוש חיות בכל קבוצה.
2. הכנת פתרון
- הכינו סקופולאמין הידרוברומיד על ידי המסתו בתמיסת נתרן כלורי 0.9% ליצירת תמיסה בריכוזים של 7.5 מ"ג/מ"ל, 5 מ"ג/מ"ל ו-2.5 מ"ג/מ"ל.
- הכינו תמיסת נתרן כלורי 0.9% ללא הידרוברומיד סקופולאמין שתשמש כזריקה לקבוצת הביקורת של חולדות.
3. הכנת ציוד וחומרים
- הכינו מיקרוסקופ של בעלי חיים קטנים.
- להכין חומרים לניסוי, כולל מזרק חד פעמי 1 מ"ל עם מחט (26 גרם); רצועות נתרן אופתלמיות פלואורסצאין; רצועת בדיקת דמעות של שירמר; אתנול מוחלט; 4% paraformaldehyde; קסילן; בלסם נייטרלי; hematoxylin, eosin; וערכת צביעה תקופתית של חומצה שיף.
4. הזרקה תת עורית
הערה: הליך זה דורש סיוע מאדם שני כדי לסייע באבטחת החולדות.
- החזיקו את גוף החולדה יציב ותפסו ומתחו את רגליה האחוריות השמאלית (או הימנית).
הערה: עוזר יכול לעזור בהחזקת החיה. - נקו את מקום ההזרקה עם אלכוהול.
- יש להכניס מזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל עם מחט (26 גרם) בבסיס קפל העור בין האגודל לאצבע.
- שאפו את המזרק על ידי משיכת הבוכנה לאחור של המזרק. כל דם במזרק מצביע על מיקום מחט לא תקין; הסר ומקם מחדש את המחט.
- יש לתת תמיסת נתרן כלורי 0.9% עם או בלי סקופולאמין הידרוברומיד בתנועה יציבה וזורמת.
- יש להזריק את כל החולדות לפי ריכוזים שונים, כאשר 0.5 מ"ל מוזרק בכל פעם וארבע פעמים ביום (בשעות 9:00, 12:00, 15:00 ו-18:00) במשך תקופה רצופה של 19 ימים, לסירוגין בין גפיים שמאל וימין.
הערה: שמות הקבוצות הם כדלקמן:
קבוצה ללא סקופולמין הידרוברומיד: 0 קבוצה (ביקורת)
קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 2.5 מ"ג/מ"ל: 2.5 קבוצה
קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 5 מ"ג/מ"ל: 5 קבוצה
קבוצה עם סקופולאמין הידרוברומיד 7.5 מ"ג/מ"ל: 7.5 קבוצה - להחזיר את בעל החיים לכלוב שלו ולפקח על נשימה והתנהגות במשך 5-10 דקות.
5. בדיקת הפרשת דמעות (בדיקת דמעות שירמר, STT)
- צור רצועת נייר סינון שונה עבור חולדות11. חתכו מחצית מפס נייר הסינון המשמש לבני אדם לאורך קו האמצע (1 מ"מ × 15 מ"מ), וחתכו את ראש הרצועה כדי להפוך אותה לחלקה.
הערה: לפני ביצוע בדיקת הפרשת הדמעות, יש לרסן ידנית את גוף החולדה כדי למנוע תנועה ולהבטיח חשיפה של עיני החולדה. - הניחו את פס נייר הסינון על 1/3 החיצוני של שק הלחמית התחתון של העפעף של החולדה.
- זמן הבדיקה במשך 5 דקות. לשלוט על סגירת העיניים של החולדה לאורך כל ההליך.
- לאחר המדידה, השתמש בפינצטה כדי להדק את רצועת נייר הסינון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ולרשום את נפח הקרע על ידי ביצוע סימן על דופן הצינור.
- מדדו הפרשת דמעות ביום 0, יום 1, יום 3, יום 5, יום 7, יום 11, יום 15 ויום 19.
6. צביעת פלואורסצאין בקרנית
- זרוק 0.5 μL של תמיסת נתרן פלואורסצאין 0.5% לתוך שק הלחמית התחתון של כל חולדה.
- יש להתבונן בקרנית תחת אור כחול במשך 3 דקות לאחר החדרת פלואורסצאין.
- רשמו את הכתמים הפלואורסצנטיים של הקרנית של כל חולדה ובדקו אם יש פגם בקרנית.
- בצעו צביעה פלואורסצאין בקרנית ביום 0, יום 1, יום 3, יום 5, יום 7, יום 11, יום 15 ויום 19.
7. תצפית היסטולוגית של רקמת הלחמית
- לאחר השלמת פיתוח המודל, מרדימים את החולדות עמוק עם הזרקה תוך צפקית של 0.4 מ"ל / 100 גרם של הידרט כלורלי מימי 10% כדי להקל על המתח של בעלי החיים. לאחר מכן, הרדימו את החולדות על ידי פריקת צוואר הרחם.
- קח את לחמית הבולבר מאותם אזורים של כל חולדה, בגודל של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ.
- תקן את הרקמות מיד ב 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות להטביע פרפין13.
- יש לחתוך חתכים בעובי 5 מיקרומטר ולהכתים עם המטוקסילין ואאוזין (HE)14 וכתם חומצה-שיף תקופתי (PAS) (יש לעקוב אחר הוראות היצרן).
8. תצפית היסטולוגית של רקמת הקרנית ובלוטת הדמעות
- לאחר השלמת פיתוח המודל, הרדימו את החולדה כמתואר בשלב 7.1.
- קח את הקרנית בצד ימין של כל חולדה וקבע אותה מיד בתמיסת פרפורמלדהיד 4%.
- חותכים את האפידרמיס הצפלי ואת הרקמה התת עורית לאורך הקו המחבר בין האוזן לפינה החיצונית של העין, מרחיבים את החתך לשני הצדדים ומבודדים עוד יותר את בלוטת האורביטל הנוספת הצהבהבה.
- הסירו היטב את פרוות החולדה והפרידו את הבלוטה החוץ-מסלולית בתמיסת נתרן כלורי 0.9%.
- מניחים את הבלוטות החוץ-מסלוליות המבודדות בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 24 שעות ומטמיעים בפרפין.
- חתכו חלקים רציפים בעובי ~5 מיקרומטר והכתימו אותם עם HE עבור דגימות רקמת קרנית ובלוטות חוץ-מסלוליות.
9. ניתוח סטטיסטי
- השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח סטטיסטי של הנתונים.
- בצע ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) כדי לנתח את הנתונים ואת מבחן ההבדל הכי פחות משמעותי (LSD) להשוואה בין קבוצות. הגדר את רמת המובהקות הסטטיסטית על α = 0.05, כאשר P < 0.05 מציין מובהקות סטטיסטית.
הערה: תוכנת SPSS 20 שימשה לניתוח סטטיסטי של נתוני הניסוי.
- בצע ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) כדי לנתח את הנתונים ואת מבחן ההבדל הכי פחות משמעותי (LSD) להשוואה בין קבוצות. הגדר את רמת המובהקות הסטטיסטית על α = 0.05, כאשר P < 0.05 מציין מובהקות סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שירמר אני בודק, SIT I
נפח הדמעות של החולדות נמדד בימים 0, 3, 5, 7, 11, 15 ו-19 לאחר תחילת הניסוי. תוצאות הניסוי הראו כי הפרשת הדמעות של קבוצת הסקופולמין (2.5 קבוצה, 5 קבוצות, 7.5 קבוצות), בהשוואה לקבוצת הביקורת (קבוצת 0), ירדה באופן מובהק, וההפרש היה מובהק סטטיסטית (P < 0.01). לא נמצאה מובהקות סטטיסטית בין קבוצת 2.5, קבוצה 5 וקבוצת 7.5 (P > 0.05). לא נצפה הבדל משמעותי בין הקבוצות השונות מבחינת מספר הימים (P > 0.05) (תרשים 1, לוח 1).
צביעת פלואורסצאין בקרנית
צביעת פלואורסצאין בקרנית בוצעה בימים 0, 3, 5, 7, 11, 15 ו-19 של הניסוי. התוצאות הראו שלא היה שום צביעה פלואורסצאין בקרנית בשום קבוצה, מה שמצביע על כך שלא נוצרו פגמים ברורים באפיתל הקרנית במהלך 20 ימי הניסוי עם ריכוזים שונים של תרופות סקופולמין (איור 2).
ניתוח פתולוגי של אפיתל הקרנית
לאחר הניסוי, רקמות הקרנית מכל חולדה נאספו עבור צביעת HE כדי לבחון את המורפולוגיה של אפיתל הקרנית ולמדוד את עובי שכבת אפיתל הקרנית. אפיתל הקרנית של קבוצת הביקורת היה מורכב מ 4-6 שכבות של תאי אפיתל מסודרים, ביניהם שכבת הבסיס כללה שכבה אחת של תאי אפיתל עמודתיים מסודרים בצורה מסודרת ומקרובה. אפיתל הקרנית של קבוצות סקופולמין 2.5, 5 ו-7 היה דק משמעותית מקבוצת הביקורת, עם מורפולוגיית תאים שטוחה ואטרופית ומבנה תאים לא מסודר. בקבוצה 7.5 היה קשר בין-תאי רופף ומבנה ואקולרי רופף בשכבת הבסיס (מסומן על-ידי החץ האדום באיור 3). בהשוואה לאפיתל הקרנית של קבוצות סקופולמין, אפיתל הקרנית של קבוצת הביקורת הרגילה הראה הבדלים סטטיסטיים בעובי שכבת האפיתל של הקרנית (איור 4).
ניתוח פתולוגי של בלוטת הדמעות
הבלוטה העיקרית להפרשת דמעות בחולדות היא בלוטת הדמעות האקסטראורביטלית15. כאשר התבוננו בפרוסות בלוטת הדמעות, נצפו שינויים במורפולוגיה של תאי האפיתל של בלוטת הדמעות עם עליית ריכוז הסקופולמין, מלווה בדלקת ובבצקת רקמות. לא נצפו שינויים כאלה בקבוצת הביקורת. תוצאות הפתולוגיה מצביעות על כך ששינויים דלקתיים של בלוטת הדמעות, בצקת התאים וניוון של תאי האפיתל הבלוטיים יכולים לשמש כאינדיקטורים לנזק תפקודי של בלוטת הדמעות16 (טבלה 2). המדדים האלה יכולים לשמש למדידת חומרת העין היבשה ביחס לכמות הפרשת הדמעות (איור 5).
ניתוח תוצאות צביעת הלחמית
מבנה הלחמית בקבוצת הביקורת שלם, ומורכב בעיקר משכבת פני השטח והלמינה פרופריה. שכבת פני השטח היא תאי אפיתל טוריים למינציה, חלקים ושלמים, עם מיקרווילי על פני התא. תאי גביע מפוזרים נמצאו בין תאי האפיתל, עם נפח תא גדול וגרגירים ריריים בציטופלסמה של התא. שכבת פני השטח של אפיתל הלחמית בשלוש קבוצות התרופות של סקופולאמין הייתה דקה יותר באופן משמעותי, מספר תאי המיקרווילי והגביע הצטמצם, מבנה סידור התאים לא היה שלם, מלווה בבצקת, וכמות קטנה של תאים דלקתיים כפי שנצפתה בצביעת HE (איור 6).
על-ידי צביעת הלחמית ב-PAS, חושב המספר הממוצע של תאי גביע לכל שדה מיקרוסקופי של 40x בשלוש דגימות בלתי תלויות של כל עכבר ובוטא כממוצע ± SD (איור 7).
איור 1: סטטיסטיקה של ערך מבחן Schirmer בכל קבוצה (mm) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צביעת נתרן פלואורסצאין של קרנית חולדה. בניסוי בן 20 הימים עם נתרן פלואורסצאין, לא נצפו ממצאים חיוביים בקרניות של כל החולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: צביעת אפיתל הקרנית ומדידת עובי. בקבוצה 7.5 היה קשר בין-תאי רופף ומבנה ואקולרי בשכבת הבסיס (מסומן על ידי החץ האדום) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים 4: נתונים סטטיסטיים של עובי אפיתל הקרנית בכל קבוצה. בהשוואה לאפיתל הקרנית של קבוצות סקופולמין, אפיתל הקרנית של קבוצת הביקורת הרגילה הראה הבדלים סטטיסטיים בעובי שכבת אפיתל הקרנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות צביעה של בלוטת הדמעות האקסטראורביטלית של חולדות. (A) קבוצה 0: בשדה הראייה, בלוטות הדמעות הראו מבנה לובולרי והיו מורכבות מצינוריות ובלוטות צינוריות, ללא חריגות ברורות במורפולוגיה של הצינורות, בעוד שהבלוטות הצינוריות הורכבו מתאי בלוטות בצורת חרוט עם שפע של חומרים ריריים בציטופלסמה, ללא בצקת ברורה ברקמות חיבור, ללא הפרעות ברורות בכלי דם אינטרסטיציאליים, וללא נמק ברור וחדירת תאים דלקתיים. (B) קבוצה 2.5: בשדה הראייה, נצפה מדי פעם ניוון של תאי האפיתל של בלוטת הדמעות, עם נפח מופחת, חללים בלוטיים מורחבים בצורה לא סדירה, וחומר מוציני מופחת בתוך החלל (מסומן על ידי החץ האדום). יש גם מדי פעם חדירה של לימפוציטים חופשיים סטרומה (מסומן על ידי החץ הכחול), אבל לא חריגות ברורות במורפולוגיה של הצינור או סימנים של בצקת נצפים. (C) קבוצה 5: בשדה הראייה, תאי אפיתל הדמעות התנוונו מדי פעם והוקטנו בגודלם, חלל הבלוטות הוגדל, החומר הרירי בחלל צומצם (חץ אדום), ונצפתה מדי פעם חדירת לימפוציטים חופשיים בסטרומה (חץ כחול), ולא נצפו חריגות ברורות במורפולוגיית הצינור או בצקת רקמת החיבור בין אונות בלוטת הדמעות. (D) קבוצה 7.5: בצקת ניתן לראות בשדה הראייה; המרווח בין בלוטות הדמעות מורחב, והסידור אינו סדיר (חץ ירוק), תאי האפיתל של בלוטות הדמעות מנוונים לעיתים קרובות, הנפח נעשה קטן יותר, והצורה אינה סדירה (חץ צהוב), לעיתים חלל הבלוטה מוגדל, החומר הרירי בחלל מצטמצם (חץ אדום), לעיתים חודר הלימפוציטים החופשיים (חץ כחול), ללא חריגות נראות לעין במורפולוגיה של הצינור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: צביעה של לחמית חולדה. בהשוואה לאפיתל הלחמית של קבוצת הביקורת, כל שלוש הקבוצות של אפיתל לחמית תרופתי סקופולאמין הראו דרגות שונות של נזק מבני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: צביעת PAS של לחמית. (A) חולדות בקרה רגילות. (B) חולדות מקבוצת סקופולמין. (C) צפיפות תאי גביע בכל קבוצה (פי 20). פס שחור = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| Schirmer I test, SIT (ערך ממוצע, יחידה [mm]) | |||||||
| קבוצה | 0 ימים | 3 ימים | 5 ימים | 7 ימים | 11 ימים | 15 ימים | 19 ימים |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
טבלה 1: מבחן שירמר של חולדות בארבע קבוצות בנקודות זמן שונות (מ"מ). לאחר החלת תרופות, הפרשת הדמעות בחולדות ירדה באופן משמעותי.
| מספר | נקרוזה | דלקת | בצקת | ניוון אפיתל |
| 0 GRP-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 GRP -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 GRP -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
טבלה 2: ציון רקמה פתולוגית של בלוטת הדמעות של חולדה. קריטריוני ניקוד: 0: בתנאים רגילים, בהתחשב בגורמים כגון גיל בעלי החיים, מין וזן, הרקמה נחשבת נורמלית;
1: השינויים שנצפו פשוט חרגו מהטווח הנורמלי; 2: נגעים ניתן לראות, אבל הם עדיין לא חמורים; 3: הנגעים ניכרים וממשיכים להחמיר; 4: הנגעים חמורים ביותר והשפיעו על כל הרקמה16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עין יבשה חסרת מים (ADDE) היא סוג חשוב של עין יבשה, המהווה כשליש מכלל אוכלוסיית העין היבשה17, והגורם העיקרי ל- ADDE הוא נזק פתולוגי לבלוטת הדמעות ודלקת13. עבור סוג זה של עין יבשה, שיטות הטיפול הקליני הנפוצות ביותר הן דמעות מלאכותיות כדי להקל על הסימפטומים או יישום מקומי של סטרואידים או cyclosporine18, בעוד שיש כמה אפשרויות טיפול עבור נזק בלוטת הדמעות. לכן, חשוב מאוד לחקור את ההשפעה של שחזור תפקוד בלוטת הדמעות על עין יבשה ולבסס מודל בעלי חיים של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות. השתמשנו בשיטה של מריחה חוזרת ונשנית של תרופות כדי לדכא את הפרשת בלוטת הדמעות בחולדות, ויצרנו מודל כרוני של חוסר תפקוד של בלוטת הדמעות בעין יבשה.
בחרנו בחולדות כדי לבנות את מודל העין היבשה הזה, שיש לו יותר יתרונות בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים19. לדוגמה, ארנבים יש גודל גוף גדול יותר דורשים מינונים רבים יותר של תרופות או זריקות תכופות יותר כדי להשיג את האפקט הרצוי. יתר על כן, ארנבים הם קצת יותר יקר, כלומר עלויות יותר עבור הניסוי. עכברים משמשים בדרך כלל גם במחקר עיניים, אך הם משמשים בדרך כלל לבניית מודלים של תסמונת סיוגרן20. מודלים אלה מתמקדים בהשוואת דלקת איברים והסננת לימפוציטים כדי לחקור את המנגנונים האימונופתולוגיים. לעכברים יש מידות גוף קטנות, אנטומיה מורכבת של בלוטת הדמעות והפרשת דמעות נמוכה, מה שמקשה על שיקוף מדויק של ייצור הדמעות. מודל חיות החולדה הוא מודל עין יבשה מתאים יותר מכיוון שהוא מאפשר זריקות תרופות נוחות, יש לו תנאי הזנה פשוטים יחסית, מתאים הן למחקרים קליניים והן למחקרים ניסיוניים, ויש לו גם יתרונות מבחינת עלות. זהו מודל טוב של בעלי חיים עבור ADDE.
יישמנו את הקולטן הכולינרגי חוסם סקופולאמין כדי לעכב את הקולטנים הכולינרגיים בגוף החולדה, להפחית את הפרשת בלוטת הדמעות ולשנות את המבנה הפתולוגי של תאי בלוטת הדמעות, אשר מדמה ביסודו את מצב בלוטות הדמעות בחולי עין יבשה. בהשוואה לשיטות אחרות, גישה זו מדמה טוב יותר את המצב הפגוע של בלוטות הדמעות במצב טבעי. שיטות אחרות, כגון שימוש בטיפות עיניים בנזלקוניום כלוריד21 או שינוי תנאים חיצוניים כגון הפחתת לחות והגברת אידוי פני העין 4,8, רק משבשות את סביבת פני השטח של העין ואינן משנות את המצב התפקודי של בלוטת הדמעות. לכן, הם אינם מתאימים למחלות עיניים יבשות כרוניות ארוכות טווח.
במדידת נפח ההפרשה של דמעות בחולדות, שיפרנו את רצועות בדיקת הדמעות של שירמר. ראשית, אנו חותכים את רצועת בדיקת הדמעות המשמשת בני אדם לאורך קו האמצע. לאחר מכן, חתכנו את החלק העליון לצורת קשת עגולה וקיפלנו אותו בעדינות בחזרה בחלק העליון כדי להקל על החדרה קלה לשק הלחמית התחתון של החולדה. יש לציין כי חולדות פעילות, וקשה למדוד דמעות במשך 5 דקות. לאחר החדרת רצועת בדיקת הדמעות של שירמר לשק הלחמית התחתון של החולדה, עצמנו ידנית את עיני החולדה כדי להגביר את הנוחות שלהן ולהימנע ממאבק במהלך המדידה הארוכה של הדמעות, מה שעלול להשפיע על תוצאות המדידה.
בעת חילוץ בלוטת הדמעות, יש צורך תחילה לאתר אותו. נקודת הלוקליזציה של בלוטת הדמעות היא נקודת האמצע בין החלק הקדמי של האוזן לבין הקנטוס הפנימי. לאחר מכן, חתכו את רקמת העור מתחת לפרווה, מזערו את כניסת הפרווה המקוטעת והפחיתו את תהליך הטיפול בשלב מאוחר יותר. במהלך תהליך המיצוי, חשוב גם לנקות את הפרווה המקוטעת במועד. במיוחד בעת הפרדת בלוטת הדמעות, השתמש במי מלח חוצצים פוספט (PBS) או מלוחים כדי לשטוף שוב ושוב ולהימנע מערבוב עם רקמות אחרות שעלולות להשפיע על תוצאות החיתוך.
היתרון של מודל בעלי החיים של העין היבשה שפותח הוא שהפרוטוקול מקשר בין ריכוזי תרופות שונים לבין דרגות שונות של פגיעה בבלוטת הדמעות. זה מספק בסיס ניסיוני לחקר הטיפול בתפקוד לקוי של בלוטת הדמעות. ליטשנו חלק מהשלבים האופרטיביים בתהליך המידול כדי לספק חומרי עזר מפורטים יותר לחוקר. בנוסף, הוספנו מדדי ניתוח למודל בעלי החיים של העין היבשה, המשלבים אינדיקטורים מורפולוגיים של הקרנית, הלחמית ובלוטת הדמעות, ספירת תאי הלחמית וניקוד מידת הפגיעה בבלוטת הדמעות. הערכנו את תפקוד בלוטת הדמעות כתוצאה מדלקת, בצקת וניוון. בחרנו את שיטות הניתוח המקיפות, החסכוניות והמדויקות ביותר כדי לשקף את מידת העין היבשה ותפקוד לקוי של בלוטת הדמעות.
עם זאת, לשיטה שלנו יש גם מגבלות מסוימות. בשל התהליך הארוך של בניית מודלים של בעלי חיים, הנסיינים צריכים להזריק שוב ושוב. למרות שיש כיום כמה שיטות להחליף זריקות ידניות, כגון משאבות סמים או מדבקות transdermal, יש עדיין כמה סיבוכים בשימוש בהם. כיצד ליישם שיטות טובות יותר כדי להפחית את תדירות התרופות, למנוע את התרחשות של סיבוכים, ולהבטיח את הדיוק של המינון היא המטרה הבאה שלנו. לסיכום, שיפרנו מודל של בעלי חיים עם עין יבשה שנגרם על ידי הזרקת סקופולמין, ומספקים בסיס ניסיוני למחקר על תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות ב-ADDE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים הקשורים לתרופות ולחומרים המשמשים בהליך זה.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי Guangdong Provincial High-Level Clinical Key Specialties (SZGSP014) ו- Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | SJZ No.4 Pharmaceutical | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Fluorescein sodium ophthalmic strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoxylin and eosin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D006 | |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | |
| Paraffin | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | YA0012 | |
| Periodic Acid-Schiff Staining Kit | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Schirmer tear test strips | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Scopolamine hydrobromide | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Small animal microscope | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 |
References
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
